[发明专利]一种基于CsPrx25超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法

说明书

本发明公开了一种基于CsPrx25超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，包括以下步骤：(1)克隆柑橘CsPrx25基因编码序列，然后进行超量表达载体构建；(2)超量表达载体转化柑橘，得到转基因植株。该方法将一个编码过氧化物酶的基因过表达载体整合到柑橘中，有效提高柑橘对溃疡病的抗性。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种基于CsPrx25超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法。

背景技术

柑橘溃疡病(Citrus bacterial canker，CBC)是由地毯黄单胞杆菌柑橘致病变种(Xanthomonas citri subsp.citri，Xcc)所引起的检疫性细菌病害，严重影响着柑橘产业的健康发展(袁承东等，1997；Pitino et al，2015)。溃疡病菌主要侵染柑橘叶片、枝梢、果实等，其中苗木、幼树受害较为严重。病树会出现落叶、枯梢、树势衰弱以及落果等现象，严重的影响了柑橘的产量和品质(何秀玲等，2007)。在溃疡病菌发病初期，柑橘叶片表层首先出现针头般大小的油渍状圆斑，随着病原菌的生长，圆形斑逐渐变得凸起，出现白色、黄色的海绵状脓疤，呈现木栓化及火山口的形状，脓疤颜色变暗发展为褐色病斑，在病原菌的刺激下叶片畸形生长，最终导致叶片上下表皮破裂，木栓化而死亡。果实感染溃疡病后会发生病斑开裂，影响外观和品质，使得经济价值大打折扣。感染严重者，会造成大面积果树枯萎坏死，毁林毁园，造成不可恢复的破坏，给柑橘产业造成巨大的损失(何秀玲等，2007)。

目前，对柑橘溃疡病的预防只能是加强检疫防范，避免溃疡病的传播和感染。柑橘溃疡病菌可以随风雨传播，也可以通过果实、苗木、接穗运输而长距离传播，防不胜防(何君等，2016)。果园一旦感染溃疡病，可以通过化学防治、生物拮抗防治、加强人工管理防治等方法来缓解溃疡病对果园的危害程度，减缓毁园速度，但是治标不治本(陈力等，2008)。培育抗溃疡病品种是最根本有效的方法。但是柑橘有高度杂合、单雄(雌)不育的特点，传统的杂交育种在柑橘育种中周期长、效率低。抗溃疡病柑橘品种迟迟没有培育出来。而分子育种具有效率高、可控性强的特点，在培育柑橘抗溃疡病新品种中得到广泛的应用(陈善春等，1996；Peng et al，2017)。

漫长的进化过程中，物竞天择，适者生存。植物抵抗病原菌的过程中进化出一套复杂的免疫防护系统。病原菌的入侵，会引起柑橘体内活性氧的变化，例如过氧化氢(Almagroet al，2009)。正常状态下，过氧化氢作为一种信号分子存在柑橘体内，一旦感染溃疡病菌后，体内过氧化氢含量迅速增多，这种过氧化物能够营造不利于病菌生活的微环境，同时将信号传递至植物防卫系统的下游，激发抗病基因的表达，从而使柑橘抵抗溃疡病的能力提升。Class III过氧化物酶(Prx)可以维持细胞活性氧的平衡，使得活性氧浓度不会过高而使植物细胞坏死(Li et al，2015)。同时，Class III过氧化物酶也可以参与细胞壁木质素的合成(Kidwai et al，2019)，进而改变细胞壁成分，加固细胞壁这个抵御病原菌入侵的第一道物理屏障。所以，Class III过氧化物酶在提高植物对病害抗性方面具有较大的应用潜力。

发明内容

本发明为提高柑橘对溃疡病的抗性提供一种新的选择，公开一种基于CsPrx25超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法。该方法将一个编码过氧化物酶的基因的过表达载体整合到柑橘中，有效提高柑橘对溃疡病的抗性。

本发明通过下述技术方案实现：

一种基于CsPrx25超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，包括以下步骤：

(1)克隆柑橘CsPrx25基因编码序列，然后进行超量表达载体构建；

(2)超量表达载体转化柑橘，得到转基因植株。

其中，步骤(1)中，克隆CsPrx25基因编码序列所采用的引物为OE-CsPrx25-F和OE-CsPrx25-R，分别具有如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示核苷酸序列。