[发明专利]一种基于CsPrx25超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法

权利要求书

1.一种基于 CsPrx25 超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，包括以下步 骤：

（1）克隆柑橘 CsPrx25 基因编码序列，然后进行超量表达载体构建；

（2）超量表达载体转化柑橘，得到转基因植株；

CsPrx25 基因的CDS序列如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求 1 所述的一种基于 CsPrx25 超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其 特征在于，步骤（1）中，克隆 CsPrx25 基因编码序列所采用的引物对为 OE-CsPrx25-F 和 OE-CsPrx25-R，引物对OE-CsPrx25-F和OE-CsPrx25-R的核苷酸序列分别为如 SEQ ID NO：1 和 SEQ ID NO：2 所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求 1 所述的一种基于 CsPrx25 超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其 特征在于，步骤（1）中，柑橘 CsPrx25 基因编码序列的克隆方法为：提取柑橘总RNA，然 后反转录为 cDNA，最后 PCR 扩增出 CsPrx25 基因编码序列 DNA 片段。

4.根据权利要求 1 所述的一种基于 CsPrx25 超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其 特征在于，步骤（1）中，超量表达载体构建方法为：以 pLGNe 为载体，利用 KpnⅠ和BamH Ⅰ酶切目的片段后连接到同样酶切的载体上，构建出超量表达载体 pLGNe-CsPrx25。

5.根据权利要求 4 所述的一种基于 CsPrx25 超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其 特征在于，pLGNe 载体具有 CaMV 35S 启动子调控下的 GUS 基因，CaMV 35S 启动子为花椰 菜花叶病毒启动子，CaMV 35S 启动子和GUS 基因的核苷酸序列分别为如 SEQID NO：3 和 SEQ ID NO：4 所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求 1 所述的一种基于 CsPrx25 超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其 特征在于，步骤（2）中，超量表达载体转化柑橘的方法为：超量表达载体通过电激法转化根 癌农杆菌，再用农杆菌介导转化柑橘外植体。

7.根据权利要求 6 所述的一种基于 CsPrx25 超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其 特征在于，遗传转化后的外植体细胞经离体培养、染色鉴定、嫁接后得到转基因植株。

8.根据权利要求 1 所述的一种基于 CsPrx25 超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其 特征在于，步骤（2）得到转基因植株后，对转基因植株进行抗性评价，判定 CsPrx25基因超 量表达与柑橘溃疡病的相关性。

9.根据权利要求 8 所述的一种基于 CsPrx25 超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其 特征在于，对转基因植株进行抗性评价前，通过 PCR 验证转基因植 株，采用的引物为 ID-CsPrx25-F 和 ID-CsPrx25-R，ID-CsPrx25-F 是 取自 载体上 CaMV 35S 的一 段序 列， ID-CsPrx25-R 是基因尾部一段序列设计而成，引物ID-CsPrx25-F和ID-CsPrx25-R的核苷酸序列分别为如SEQ ID NO：5 和 SEQ ID NO：6 所示的核苷酸序列。

10.根据权利要求 9 所述的一种基于 CsPrx25 超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其 特征在于，PCR 验证后，利用实时荧光定量 PCR 进行 CsPrx25 基因表达量检测，采用的引物为 RT-CsPrx25-F 和 RT-CsPrx25-R，引物RT-CsPrx25-F 和 RT-CsPrx25-R的核苷酸序列分别为如 SEQ ID NO：7 和 SEQ ID NO：8 所示的核苷酸 序列，实时荧光定量PCR 内参为柑橘 Actin 基因，采用引物为 RT-CsActin-F 和 RT-CsActin- R，引物RT-CsActin-F 和 RT-CsActin- R的核苷酸序列分别为如 SEQ ID NO：9 和 SEQ ID NO：10 所示的核苷酸序列。