[发明专利]枯草芽孢杆菌及其在发酵生产腺苷酸脱氨酶中的应用

说明书

本发明涉及微生物筛选及发酵领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌及其在发酵生产腺苷酸脱氨酶中的应用。本发明提供了一种产腺苷酸脱氨酶的菌株，所述菌株为枯草芽孢杆菌菌株(Bacillus subtilis ESP710)，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M2018827。本发明提供了一种生产腺苷酸脱氨酶的方法，其使用上述所述的菌株进行液态发酵生产得到腺苷酸脱氨酶。所得到的腺苷酸脱氨酶的发酵酶活远远高于目前已报道的发酵酶活，发酵酶活为14000‑18000U/mL，液态发酵的方式更易于产品工业化生产，发酵液发酵酶活高，发酵使用常规、可溶性的原料，生产染菌风险小，产品易于分离。

技术领域

本发明涉及微生物筛选及发酵领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌及其在发酵生产腺苷酸脱氨酶中的应用。

背景技术

高I+G(5′-肌苷酸钠和5′-鸟核酸钠)酵母抽提物是在原酵母抽提物的基础上，强化了产品中呈味核苷酸物质含量的酵母抽提物，作为天然、营养的高端调味品可替代味精，具有增鲜、提味和降盐等作用，符合现代人的饮食消费习惯和营养需求趋势。酵母抽提物中I+G的含量直接影响着产品的风味品质和生产成本。在国内的研究中，酵母抽提物中I+G含量在10％左右，而国外有I+G含量达到20％的酵母抽提物的专利报道。安琪酵母股份有限公司通过增加对高蛋白高核酸酵母的热提取时间和pH的改进，在抽提物溶液中酵母RNA由原来的13％提高到25％以上，再通过酶解工艺改进可以直接生产出18％以上的I+G产品，再对该产品进行超滤，产品各项性能得到明显改善，产品各项指标达到欧美高端产品质量水平，属国内首创。

高I+G酵母抽提物的生产过程中，首先使用5’-核苷酸的磷酸二酯酶对单链DNA和RNA进行水解，生成腺苷酸(AMP)和鸟苷酸(GMP)，再由5′-腺苷酸脱氨酶进行作用，将腺苷酸转化为肌苷酸(IMP)。在高I+G酵母抽提物制备过程中，5′-腺苷酸脱氨酶起着至关重要的作用，5′-腺苷酸脱氨酶的酶活力及作用性能直接影响肌苷酸生成及高I+G酵母抽提物的质量。因此，获得高催化活力、高性能的5′-腺苷酸脱氨酶是解决高I+G酵母抽提物生产的关键技术之一，具有重要的研究意义和市场价值。

5′-腺苷酸脱氨酶最早由鼠骨骼肌和人红血细胞制备，现代化工业生产中使用的酶大都使用酵母、青霉、曲霉及毛霉等微生物发酵法制备，其中使用最多的菌种是米曲霉和蜂蜜曲霉，近年日本也有用基因工程链霉菌进行生产的专利报道。脱氨酶生产早期通常使用的是固态发酵法生产，该方法的缺点是固体原料中的色素、蛋白质、糖及无机盐等被混杂到酶液中而使酶的提取纯化和使用带来困难，而且固体酶的酶活往往很低，随后人们改用液体发酵法生产，该方法虽然能有效地克服固态发酵的某些缺点，但酶的活性及稳定性仍未解决。5′-腺苷酸脱氨酶的工业化生产，目前，国际上只有日本天野酶株式会社拥有成熟的技术和产品，国内的广西科学院也有产品在试销，但产品的稳定性和应用效果还有待进一步验证。

近年来有关5′-腺苷酸脱氨酶的研究报道不多，并且主要仍集中在菌种选育和发酵条件优化方面。刘昌军等通过菌种筛选和发酵工艺优化，利用米曲霉固态发酵方式获得5′-腺苷酸脱氨酶的表达量为1543.48u/g鲜曲；普为民等从多株青霉及曲霉中筛选到一株腺苷酸脱氨酶蜂蜜曲霉产生菌，经紫外线及复合诱变处理及发酵工艺优化后，使原始菌种脱氨酶表达量提高了16倍，最终得到脱氨酶的表达量达到1300u/g；段作营等通过固态发酵方式获得米曲霉脱氨酶的表达量约1560u/g，并使用盐析沉淀方法对该酶进行了纯化并对酶学性质进行了初步研究。

中国申请号CN201510306409.0公开了一种腺苷酸脱氨酶的液态发酵方法，其包括下述步骤：(1)菌种活化：将蜂蜜曲霉孢子接入培养基培养；(2)种子制备：孢子悬浮液按1-2.5％接种量接入种子摇瓶培养基培养；(3)种子罐培养：按0.1-0.5％接种量，将种子菌液接入到种子罐中培养，其中转速为50-150rpm，通风比为1:0.3-1:1.2；(4)发酵罐生产：按2-10％的接种量，将种子培养液接入发酵罐培养，其中转速100-200rpm，通风比1:0.3-1:1.2，所得到的腺苷酸脱氨酶的酶活为2000-3100U/mL。