[发明专利]一种基于荧光化学反应系统体外高通量筛查皮肤致敏原的方法

说明书

本发明公开了一种基于荧光化学反应系统体外高通量筛查皮肤致敏原的方法，包括以下步骤：(一)荧光化学反应系统的制备；(二)致敏原筛选试验；(三)皮肤致敏性预测。该方法快速、简便、成本低、标准化程度高，适用范围广泛，可以对化学品、化妆品、植物提取物、化妆品原料等进行快速有效的检测和评估。

技术领域

本发明属于皮肤知敏原筛查技术领域，具体涉及一种基于荧光化学反应系统体外高通量筛查皮肤致敏原的方法。

背景技术

变应性接触性皮炎(allergic contact dermatitis，ACD)是皮肤对外源物质产生的免疫原性皮肤反应，即皮肤重复接触某种物质后机体产生的免疫介导的皮肤反应。ACD是人类最常见的接触性免疫疾病之一，据估计15％-20％的人会对一到多个市售的化学品产生皮肤过敏。ACD的临床表现以瘙痒、红斑、丘疹、水肿、水疱、融合性水疱为表现特征，造成人体很大的痛苦，严重影响生活质量。因此，对于有意或无意皮肤接触的物质进行致敏测试是安全性评价的重要内容。可能含有致敏原的产品包括日用化学品、化学品、药品、农药、纺织品、器械、环境污染物等。

传统评价方法采用实验动物作为人的替身，模拟人体接触致敏原的整个过程，通过观察动物出现的临床症状判定受试物是否具有致敏性，这些方法包括豚鼠最大化试验(GPMT)、豚鼠Buehler试验(BT)和小鼠局部淋巴结试验(LLNA)。动物在整个实验过程中表现要为痛苦。在3R原则的倡导下，在欧盟化妆品法规 1223/2009/EU、欧盟《化学品注册、评估、授权和限制》(简称REACH法规) 为代表的全球48个国家化妆品法规的约束下，禁止化妆品的动物实验，寻找替代方法已成为毒性测试方法变革的重要内容。

为加速替代方法的开发，经济与合作发展组合(Organization for EconomicCooperation and Development，OECD)建议在有害结局通路(adverse outcome pathway，AOP)的框架内开发毒性测试替代方法。AOP认为任何毒性作用的过程均由分子启始事件、若干相互关联的关键事件组成，最终导致有害结局。皮肤致敏过程也是遵循这样的AOP。分子起始事件是外源物质渗入表皮层与皮肤蛋白共价结合形成半抗原复合物，随后角质形成细胞激活发生炎性反应，同时被激活的树突状细胞迁移至局部淋巴结，将半抗原复合物呈递至T淋巴细胞，最终导致T细胞的增殖和分化。当皮肤再次接触相同过敏原时进入激发阶段，触发炎性反应。针对皮肤致敏AOP起始事件，基于肽或蛋白反应活性的方法用以筛选并鉴定潜在皮肤致敏物质，开发了直接多肽反应试验(direct peptide reactivity assay，DPRA)。DPRA立足于AOP中的分子起始事件，通过检测待测物对半胱氨酸和赖氨酸多肽的消除从而评估待测物的致敏性。2013年欧洲替代方法研究中心将DPRA推荐为皮肤致敏试验的方法，2015年DPRA方法被OECD接受并公布为指南442C。尽管直接多肽反应试验准确度和灵敏度较高，易于操作，且便于批量检测，但仍然存在局限性，DPRA试验依赖于对未反应多肽的检测，可能受到不同亲水亲核试剂盒疏水致敏物的影响。原因是大多数皮肤过敏原水溶性较差，与多肽溶液混合时可能析出沉淀，不能反映代谢活化或非生物转化，对前半抗原致敏性预测存在困难，对于混合物特别是含未知成分混合物的致敏性预测困难等。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于荧光化学反应系统体外高通量筛查皮肤致敏原的方法，该方法快速、简便、成本低、标准化程度高，适用范围广泛，可以对化学品、化妆品、植物提取物、化妆品原料等进行快速有效的检测和评估。

本发明的上述目的是可以通过以下技术方案来实现：一种基于荧光化学反应系统体外高通量筛查皮肤致敏原的方法，包括以下步骤：

(一)荧光化学反应系统的制备：制备5-二甲氨基-N-2-巯基乙基萘-1-磺酰胺，简称DCYA；

(二)致敏原筛选试验

(2.1)建立待测组、阴性对照、阳性对照和空白对照各实验组，其中各实验组的组成如下表1所示：