[发明专利]一种特异性识别蛋白MEX3D的多克隆抗体制备方法及其应用

权利要求书

1.一种特异性识别蛋白MEX3D的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)蛋白MEX3D抗原表位分析：通过抗原表位分析选择目的片段用作蛋白MEX3D的重组表达，所述目的片段的基因序列如序列表中SEQ ID N0.1所示，在上、下游引物分别引入BamH1、Not I酶切位点及其同源臂；

(2)提取小鼠正常睾丸组织mRNA，并以其作为模板进行反转录PCR，合成cDNA第一链然后以此为模板，进行PCR扩增；

(3)扩增的PCR产物经纯化后，将PCR产物MEX3D DNA目的片段前后分别引入EcoR I与Hind III酶切位点及同源臂，并与用EcoR I与Hind III切开的的pET28a在TDNA连接酶的作用下进行连接。

(4)连接产物转化入感受态菌BL21，挑选阳性克隆，提取质粒，经双酶切鉴定后测序，将测序正确的克隆抽提质粒，并转入BL21菌株，IPTG诱导表达，表达的目的蛋白经Ni柱纯化后，得到目的蛋白MEX3D；

(5)以步骤(4)的目的蛋白MEX3D作为抗原免疫小鼠，完成免疫周期；

(6)以细胞株的细胞通过小鼠生产，而获得特异性识别蛋白MEX3D多克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的特异性识别蛋白MEX3D的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中上游引物、下游引物具体序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。

3.根据权利要求2所述的特异性识别蛋白MEX3D的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(6)中的细胞株为大肠杆菌BL21(DE3)。

4.根据权利要求3所述的特异性识别蛋白MEX3D的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述PCR扩增的模式如下：95℃预变性30s，然后95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸60s的循环，总共进行35次循环，最后再经72℃延伸5min后，于12℃结束反应。

5.根据权利要求4所述的特异性识别蛋白MEX3D的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述多克隆抗体为小鼠IgG2a亚型多克隆抗体。

6.一种权利要求1-5任一项所述特异性识别蛋白MEX3D的多克隆抗体的制备方法在试验样品中蛋白MEX3D的定量检测中的应用。