[发明专利]一种基于TdT信号放大技术的试纸条及其制备方法

权利要求书

1.一种基于TdT信号放大技术的试纸条，其特征在于，背衬底板上沿层析方向依次固定样品垫、结合释放垫、反应膜和吸收垫，且依次相邻的两者间部分重叠；

结合释放垫上包覆树枝状纳米金复合物，树枝状纳米金复合物包括纳米金-夹心适配体1-PolyN1复合物和纳米金-PolyN2复合物，纳米金-夹心适配体1-PolyN1复合物中修饰有PolyN1扩增序列的夹心适配体1以纳米金颗粒为中心呈辐射状分布，纳米金-PolyN2复合物中PolyN2序列以纳米金颗粒为中心呈辐射状分布，纳米金-夹心适配体1-PolyN1复合物与纳米金-PolyN2复合物通过互补杂交固定；

PolyN1与PolyN2为互补序列，N1为A或T；

反应膜上沿层析方向依次设有检测线和质控线，检测线包被夹心适配体2，质控线包被与PolyN2互补的序列探针；

夹心适配体1和夹心适配体2为能够捕获目标检测物的DNA序列；

纳米金颗粒的粒径为10～20nm，PolyN1的长度为100～300个碱基，PolyN2和与PolyN2互补的序列探针的长度为8～15个碱基；

所述树枝状纳米金复合物的制备步骤包括：纳米金-夹心适配体1-PolyN1复合物与纳米金-PolyN2复合物于杂交体系中，90℃杂交2min，即得树枝状纳米金复合物；

所述纳米金-夹心适配体1-PolyN1复合物的制备步骤包括：TdT酶介导下，纳米金-夹心适配体1复合物与dN1TP于反应缓冲液中，37℃扩增2h，即得纳米金-夹心适配体1-PolyN1复合物；

夹心适配体2包被于反应膜上形成检测线，夹心适配体2的3’端修饰的生物素结合链霉亲合素，链霉亲合素连接反应膜；与PolyN2互补的序列探针包被于反应膜上形成质控线，与PolyN2互补的序列探针的3’端修饰的生物素结合链霉亲合素，链霉亲和素连接反应膜。

2.权利要求1所述基于TdT信号放大技术的试纸条的制备方法，其特征在于，步骤包括：

a. 释放垫浸泡吸收含有树枝状纳米金复合物的缓冲液，干燥，即得包覆树枝状纳米金复合物的释放垫；

所述树枝状纳米金复合物的制备步骤包括：纳米金-夹心适配体1-PolyN1复合物与纳米金-PolyN2复合物于杂交体系中，90℃杂交2min，即得树枝状纳米金复合物；

所述纳米金-夹心适配体1-PolyN1复合物的制备步骤包括：TdT酶介导下，纳米金-夹心适配体1复合物与dN1TP于反应缓冲液中，37℃扩增2h，即得纳米金-夹心适配体1-PolyN1复合物；

纳米金-夹心适配体1复合物的制备步骤包括：夹心适配体1与胶体金混匀，20℃～28℃反应12～16h；加入PB缓冲液，室温震荡0.5～1 h；再分批加入pH7.4、含氯化钠的PB缓冲液，20℃～28℃反应12～16h；去离子水离心洗涤3～4次，即得纳米金-夹心适配体1复合物；

b. 含有标记链霉亲和素-生物素的夹心适配体2的溶液与含有标记链霉亲合素-生物素的与PolyN2互补的序列探针的溶液经划膜仪分别包被于反应膜上形成沿层析方向依次间隔分布的检测线和质控线，即得标记检测线和质控线的反应膜；

c. 沿层析方向将样品垫、包覆树枝状纳米金复合物的结合垫、标记检测线和质控线的反应膜和吸收垫依次固定于背衬上，前后依次相邻的两者间部分重叠。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，胶体金的制备步骤包括：向加热至沸腾的氯金酸溶液中加入柠檬酸钠进行反应，反应结束后停止加热，搅拌过夜，即得胶体金。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤b，含有标记链霉亲和素-生物素的夹心适配体2的溶液的制备步骤包括：夹心适配体2原液与链霉亲和素混匀后，4℃孵育12～16h。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤b，含有标记链霉亲合素-生物素的与PolyN2互补的序列探针的溶液的制备步骤包括：与polyN2互补的序列探针原液与链霉亲和素混匀后，4℃孵育12～16h。

6.基于TdT信号放大技术的检测方法，其特征在于，利用权利要求1所述的试纸条检测待测样品液。