[发明专利]一种羊瘁狙疫苗的制备方法

说明书

本发明涉及兽医微生物学技术领域，具体涉及一种羊瘁狙疫苗的制备方法。该疫苗的制备方法包括：菌株的筛选、菌株的培养、菌株毒力验证及疫苗制备。本发明的菌株为分离自青藏高原牧区的高产毒C型产气荚膜梭菌(海C1菌株)，常规培养产毒能力可达4000MLD/ml，通过优化菌株最佳产毒条件、改进培养基配方，确定最佳产毒时间等参数，可使该C型产气荚膜梭菌(海C1菌株)产毒素的能力平均达6000～8000MLD/ml，远高于常规疫苗生产用菌株的产毒素能力400～1000MLD/mL，且通过培养条件优化，使海C1菌株的培养特性及产毒能力比较稳定，大大降低了生产成本，提高了生产效率。

技术领域

本发明涉及兽医微生物学技术领域，具体涉及一种羊瘁狙疫苗的制备方法。

背景技术

C型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是引起羊瘁狙的主要病原，为革兰氏阳性有荚膜不运动的厌氧大杆菌。该菌产生的致死毒素主要是和β毒素，该病的发病率可达40％～50％，死亡率可高达100％。由于本病发病急、死亡快、因此对于本病的防制主要用疫苗进行免疫预防。

羊瘁狙疫苗免疫效果的好坏主要取决于制备疫苗菌株的产β毒素的能力，只有提高了抗原浓度，才能保证疫苗的效价及对动物的保护效果。现用羊瘁狙疫苗常规疫苗生产用菌株的产β毒素能力一般在400～1000MLD/ml。且培养困难，不易制备大量的毒素抗原。根据朱良全等在《c型产气荚膜梭菌合成培养基使用参数及培养毒素浓缩工艺优化》文献报道，所用菌株CVCC60102株的产毒力在500～1000MLD/ml；刘泽文等在《C型产气荚膜梭菌不同菌株交叉免疫保护力研究》中报道的菌株C59-2、C59-37和C59-38三株菌的产毒能力均在1000MLD/ml以下。菌株的产毒能力较低，将会出现如下几个问题的出现：(1)疫苗生产效率低下，企业生成成本提高；(2)疫苗中抗原含量降低，免疫保护力不足；(3)疫苗的免疫期缩短，需增加免疫次数，提高劳务成本；(4)抗原量过低或勉强能达到保护水平，存在潜在的免疫失败风险；(5)标准菌株与地方流行性菌株存在交叉免疫效果不良的现象，造成免疫失败。

因此，筛选具有优良产毒特性的地方高产毒菌株，对于提高羊瘁狙疫苗的免疫保护效果十分有必要；另外，通过优化培养方法，提高菌株的稳定性及产毒效率，对于提高生产效率，降低成本输出具有重要的意义。

发明内容

基于上述陈述，本发明的目的在于提供一种羊瘁狙疫疫苗的制备方法。

一种羊瘁狙疫疫苗的制备方法，包括如下步骤：

步骤1菌株的筛选：

S1：菌株厌气培养，将19株分离菌株分别接种到肉肝胃酶消化汤培养基中，37℃培养12h，抹片镜检呈单一的梭状杆菌，革兰氏染色阳性(见附图1)；

S2：DNA检测，利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取19株菌株的DNA，利用设计的16SrRNA通用引物进行PCR扩增，扩增产物经1.5％琼脂糖电泳检测可在1450bp处检测到目的条带，将扩增产物测序分析，与GENBANK中公布的C型产气荚膜梭菌的同源性在99％以上，证明菌株血清型符合C型产期荚膜梭菌属的特性；

步骤2菌株的培养：

将步骤1检测后的菌株接种到基础培养基中，37℃厌气培养，培养时间为2～24h，pH为7.5～8.8，收集培养液备用；

步骤3菌株毒力验证：

将步骤2的培养菌物在不同培养时间取样，4000r/min离心10min，上清液做递倍稀释，稀释比例为1:10，1:100，1:200，1:400，1:600，1:800及1:1000，皮下注射16～20g小白鼠，观察小白鼠死亡情况；

步骤4疫苗制备：