[发明专利]一种基于纤维小体的毕赤酵母表面共展示系统及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种基于纤维小体的毕赤酵母表面共展示系统及其构建方法和应用，属于分子生物学、食品以及基因工程技术领域。本发明所述系统包括锚定蛋白和多蛋白展示底架蛋白，所述锚定蛋白为酿酒酵母细胞壁蛋白Sed1p；所述多蛋白展示底架蛋白为梭菌纤维小体的人工迷你脚手架蛋白MixA2。本发明提供的基于纤维小体的毕赤酵母表面共展示系统能实现在细胞表面的多蛋白共展示；利用重组菌制备与对接模块(dockerin)融合表达的外源蛋白，不需要经过纯化，能直接通过重组蛋白上的对接模块(dockerin)和MixA2上的粘连模块(Cohesin)特异性结合，使多个蛋白展示在细胞表面，有效节约重组蛋白的制备成本。

技术领域

本发明属于分子生物学、食品以及基因工程技术领域，具体涉及一种基于纤维小体的毕赤酵母表面共展示系统及其构建方法和应用。

背景技术

微生物细胞表面展示是通过将靶蛋白基因序列与特定的载体蛋白基因序列融合后导入微生物宿主细胞，靶蛋白在载体蛋白的引导下表达并定位与微生物细胞表面，保持相对独立的空间构象和原有的生物学活性。表面展示系统具有高效性和安全性的优势，是一个表达外源蛋白良好的平台，近年来它的应用也越来越广泛，如将具有催化活性的蛋白展示于酵母等微生物细胞表面就形成了全细胞催化剂；将外源蛋白展示在细胞表面，发现与其相互作用的物质，从而筛选出新药的先导化合物；将抗原蛋白展示在细胞表面，构建方便快速检测疫苗安全的体系等。因此表面展示系统拥有良好的商业化和工业化前景。

酵母细胞表面展示是一种基于酵母菌表达系统的技术，是将待展示的目的蛋白的编码基因与特异性的锚定蛋白的基因序列融合，构建融合性的重组表达载体，然后将重组表达载体转化酵母细胞中。在诱导物存在的条件，诱导酵母宿主细胞表达并分泌融合蛋白。由于锚定蛋白具有特定的结构功能域，能够特异性地引导目的蛋白进入酵母细胞壁结构中，从而将外源目的蛋白分子锚定于酵母细胞表面。酵母的细胞壁主要由甘露糖蛋白、几丁质和D-葡聚糖组成，锚定蛋白Sed1p属于糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白，是由甘露糖蛋白与细胞壁中葡聚糖通过共价键的方式连接。GPI对酵母的生长是必不可少的，同时在酵母细胞表面展示中起着固定蛋白在细胞表面的重要作用。

纤维小体(cellulosome)是一种多酶复合体，它通过特定的方式组装于于厌氧微生物细胞表面，通过所携带的多种水解酶系之间的协同作用，催化纤维素和半纤维素的降解，显著改善这些厌氧微生物细胞对多糖物质的利用效率。

荧光蛋白能在细胞内直接表达，促使了荧光的可视化，使其用途更加广泛，主要与其他靶蛋白或抗体联用，用流式细胞仪或酶联免疫吸附测定细胞表面的蛋白。选用荧光蛋白标记的最大好处是无毒且无侵害性，无需辅酶的参与就能自身发光。荧光蛋白主要有红黄蓝绿青荧光蛋白，其中最常用的是绿色荧光蛋白(GFP)，其他荧光蛋白大多是由GFP突变而来，能呈现能黄青蓝荧光。而mCherry来源于盘状海葵，mCherry的结构十分稳定，具有良好的光稳定性，抗光漂白的优点。它们的蛋白结构有一定的相似性，都是由β链形成的一个空心圆柱体，但是mCherry与GFP的氨基酸序列的同源性很低。

细胞表面多蛋白共展示体系的定量分析一直是一项较为棘手的问题，只能通过多酶体系的最终催化效果来比较，难以对细胞表面的外源蛋白的展示效率进行定量。

发明内容

有鉴于背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种基于纤维小体的毕赤酵母表面共展示系统(工程菌)；本发明的另一目的是提供一种上述基于纤维小体的毕赤酵母表面共展示系统的构建方法；本发明还有一个目的是提供一种上述基于纤维小体的毕赤酵母表面共展示系统的荧光定量分析方法。

本发明提供了一种基于纤维小体的毕赤酵母表面共展示系统，包括锚定蛋白和多蛋白展示底架蛋白，所述锚定蛋白为酿酒酵母细胞壁蛋白Sed1p；所述多蛋白展示底架蛋白为梭菌纤维小体的人工迷你脚手架蛋白MixA2。

本发明提供了上述基于纤维小体的毕赤酵母表面共展示系统的构建方法，包括如下步骤；