[发明专利]一种融合蛋白THG及其应用

说明书

发明公开了一种渔用口服或浸泡型重组融合蛋白THG及其制备方法和应用，利用基因工程技术将透皮增强肽基因序列(TDZ)、渔用生长激素基因(HG)和细胞穿膜肽基因序列(TAT)进行柔性结合，获得THG融合基因，转化大肠杆菌，筛选获得了一株可生产THG融合蛋白的基因工程菌。该菌株为大肠杆菌BL21（DE3）hsdS gal pET‑28a‑THG；CCTCC NO：M 2018014，该培养物已于2018年01月09日由中国典型培养物保藏中心收到，并登记入册。将该基因工程菌株进行诱导表达和THG融合蛋白的纯化，获得THG融合蛋白。该融合蛋白能降低机体生物屏障，能有效地促进细胞同化作用，加快鱼类生长，可减少鱼类养殖中的粪便排放，环境和生态效益好，在渔业生产上具体明显的经济价值和应用前景。

技术领域

本发明涉及基因生物工程技术领域，具体涉及一种重组融合蛋白THG的菌株，还涉及一种重组融合蛋白THG的序列信息，还涉及一种能表达重组融合蛋白THG的制备方法，以及一种重组融合蛋白THG在促进鱼类生长、提高鱼类饲料利用率等方面中应用。

背景技术

鱼类生长激素(growth hormone，GH)是由鱼脑垂体远端的嗜酸性细胞分泌与合成的一类单链多肽。它在鱼的生长、能量的固定、性腺的发育等方面都具有重要的调节作用，也是水产养殖中一直备受研究者关注的领域。鱼类生长激素能够促进鱼类生长发育，提高饵料利用率，减少饵料的损耗，减少化学类药物的使用，降低对水环境的污染程度，对促进水产业的发展具有重要的经济和社会意义（王 伟，汪亚平，朱作言，人工合成草鱼生长激素cDNA在大肠杆菌中的表达，遗传学报，2001，28(4)：306～312）。生长激素在鱼类之间具有很高的保守性，不同种鱼的 GH 都可促进某一种鱼类的生长，表明一种外源生长激素可以对多种鱼类起作用。早期的研究发现，将动物的脑垂体匀浆后，加入饵料中，投喂给鱼，鱼体生长加快，似乎鱼体的肠道能够吸收具有生物活性的生长激素，经研究证实，鱼体的后肠上皮细胞，通过泡饮作用，可以吸收完整的大分子蛋白，具有生物学活性的生长激素可以进入鱼体血液中，从而促进鱼体生长（王 伟，孙永华，汪亚平，朱作言，草鱼生长激素在毕赤酵母中的高效分泌表达，遗传学报，2003，30 (4)：301～306）。多肽生长激素具有调节和促进生长的作用，是脊椎动物（包括鱼类）体内固有的成分，并可在动物体内自动降解而不影响人类食用。现行的鱼用生长激素，常用注射的方式对鱼类有效，口服或浸泡等方式，效果有限，也就鲜有报道。原因在于，生长激素蛋白分子缺乏穿膜机制。

透皮增强肽，也称为蛋白转导域，是目前最强、最快的跨膜转运分子，具有水性、低裂解性并通过非吞噬作用进入各种细胞膜等特点，具有很强的跨膜转运能力，能够携带比其相对分子质量大100 倍的外源性大分子进入细胞。同时，现在研究最多、应用范围最广的细胞穿膜肽(Trans-activating transcriptional activator, Tat) Tat蛋白中存在3个功能结构域，分别是：位于N一端的酸性区，主要起反式激活的功能；位于第22-37位氨基酸之间的DNA结合区，该区域富含半胱氨酸；位于第47-60位氨基酸之间的碱性区，是主要的蛋白转导结构域，参与Tat蛋白的细胞内化作用。Schwarze发现位于Tat蛋白中第47-57位之间的11个氨基酸YGRKKRRQRRR 不仅能够独立穿过细胞膜，而且其穿膜效率比全长的Tat蛋白还要高，这段多肽即是TAT 穿膜肽。本专利就是将透皮增强肽、鱼用生长激素和分子穿膜肽等三个基因进行柔性融合，获得有穿膜活性的生长激素蛋白，解决了生长激素口服，鱼体不能吸收，效果差的问题。而在这方面，尤其是在多基因片段之间柔性融合方面，更未见报道。

发明内容

本发明的主要目的是提供了一种THG融合蛋白，其序列为SEQ ID NO.2所示。本发明首次将透皮增强肽(TDS)、鱼生长激素(GH)、细胞穿膜肽(TAT)与融合表达，获得的融合蛋白可以顺利穿过鱼体鳃部细胞和肠道膜细胞，进入鱼体循环系统中，可直接发挥其促生长作用。