[发明专利]一种腺嘌呤碱基编辑工具及其用途

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种腺嘌呤碱基编辑工具及其用途。本发明提供一种融合蛋白，包括ecTadA‑ecTadA*二聚体片段和SpCas9‑D10A nickase片段，所述ecTadA‑ecTadA*二聚体片段包括ecTad片段和ecTadA*片段。本发明所提供的腺嘌呤碱基编辑工具在ecTadA‑ecTadA*二聚体片段中ecTadA片段相对于野生型存在R153P、N46A氨基酸突变，可以限制ecTadA与RNA的结合，在将sgRNA 5’端4‑7位的A突变为G的碱基编辑中，可以极大地降低甚至消除腺嘌呤碱基编辑工具的RNA脱靶效应。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种腺嘌呤碱基编辑工具及其用途。

背景技术

CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR-associated protein)是目前最有效、最便捷的基因组编辑技术。Cas9核酸酶在引导RNA(guide RNA,sgRNA) 引导下，可以到达基因组特定靶点，对其进行切割，从而产生DNA双链断裂(double strand breaks,DSB)，然后通过内源的DNA修复机制来实现编辑。DNA修复机制包括非同源末端连 接(Non-Homologous End Join,NHEJ)和同源重组修复(Homologous Directly Repair,HDR)。其中， NHEJ修复的结果是随机引入插入、缺失，导致基因的失活，这在基因组修复中占据主要地 位。而HDR可利用模版进行准确修复，从而完成基因突变的校正。

但实际上，HDR介导的准确修复的几率很低，通常小于5％，因此极大限制了CRISPR/Cas9 从科研向应用的转化方面的应用。尤其是基因精准治疗方面，一直是基因编辑领域的一大难 题。

最近新开发的碱基编辑器(Base Editor,BE)成功解决了上述问题，大大提高了基因突变的 校正效率。现有的碱基编辑器有胞嘧啶碱基编辑工具(Cytosine Base Editor，CBE)和腺嘌呤碱 基编辑工具(Adenine Base Editor,ABE)两种。

CBE和ABE是将RuvC结构域失活的Cas9D10Anickase(nCas9)和胞嘧啶脱氨酶/腺嘌呤 脱氨酶整合在一起，在sgRNA的引导下到达靶向位点并与sgRNA互补的DNA链进行结合，胞嘧啶脱氨酶对周边一定范围的胞嘧啶C进行脱氨成为尿嘧啶U，U可以与腺嘌呤A互补配对，经过DNA的复制，U最终会被A的互补配对碱基T所取代；类似的，腺嘌呤脱氨酶对 周边一定范围的腺嘌呤A进行脱氨成为次黄嘌呤I，I可以与胞嘧啶C互补配对，经过DNA 的复制，I最终会被C的互补配对碱基G所取代。从而达到C-to-T或A-to-G的目的。在经过 核定位信号以及密码子的优化后，目前BE4max和ABEmax的效率最高，BE4max对应的编 辑窗口是sgRNA5’端的4-8位，ABEmax对应的编辑窗口是sgRNA 5’端的4-7位。

目前应用最广泛的ABEmax中的脱氨酶是大肠杆菌腺嘌呤脱氨酶ecTadA进化后的变体， 其中，内源状态的ecTadA只具有编辑RNA的功能。近期研究发现ABEmax碱基编辑器作用 过程中会产生严重的RNA脱靶效应(off-Target)⁵，极大的限制了此碱基编辑器的应用。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种腺嘌呤碱基编辑工具及其用 途，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供一种融合蛋白，包括ecTadA-ecTadA*二聚体片段和SpCas9-D10A nickase片段，所述ecTadA-ecTadA*二聚体片段 包括ecTad片段和ecTadA*片段。

在本发明一些实施方式中，所述ecTadA片段的氨基酸序列包括：