[发明专利]一种含有自体真皮成纤维细胞透明质酸凝胶剂的构建方法

说明书

本发明提供一种含有自体真皮成纤维细胞透明质酸凝胶剂的构建方法，包括将体外扩增的真皮成纤维细胞与凝胶装载进入特殊药用软膏管，使用时凝胶与活细胞将同时敷在患处，凝胶包裹活细胞，延长制剂中的细胞在体外的活性时间。本发明延长活细胞存活时间，真皮成纤维细胞活细胞作为主要药效成分，该细胞在患处皮肤缺损时期，覆盖患处，分泌I型胶原蛋白，促进患处组织真皮细胞和表皮细胞的增殖，促进患处愈合，用于烧伤创伤、大面积植皮、及其他急需大面积皮肤缺损的临床需求，具有低排异、可持续供应等优点。

技术领域

本发明主要涉及自体细胞体外生产技术领域，透明质酸凝胶制剂制造领域，凝胶软膏管包材制造领域,尤其涉及一种含有自体真皮成纤维细胞透明质酸凝胶剂的构建方法。

背景技术

自体细胞的体外生产技术目前已经十分成熟。成人自体真皮的成纤维细胞体外增殖技术，已经达到了产业化要求，在国外已经有该产品注射剂上市，国内也出现类似产品。现在成人真皮成纤维细胞的规模化生产朝向高效、高纯度、高活性的方向发展；产品用途可直接制备注射剂，也可以作为其他制剂的主要原料成分。

活细胞在不能使用注射剂的临床治疗中，需要依托细胞固化技术。现在已有多项技术，将活细胞固定或构建在片状凝胶、生物膜或化工合成膜、新材料支架等。在用于皮肤科或皮肤缺损治疗中，临床更倾向于片状敷料或凝胶敷料制剂。

由于活细胞容易失活的特点，目前上市的成品制剂，还受到产品保存条件严苛、货架期短等特殊要求的制约。

发明内容

本发明提供一种含有自体真皮成纤维细胞透明质酸凝胶剂的构建方法，针对现有技术的上述缺陷，提供一种含有自体真皮成纤维细胞透明质酸凝胶剂的构建方法，包括以下步骤：

第一步：活细胞原料的提取：

S1：自体组织采集：对细胞使用人实施外科手术，采集颈后厚皮组织，面积1～2mm²；

S2：自体细胞体外生产纯化：厚皮组织分离出真皮部分，放入培养基增殖，成纤维细胞逐渐从组织中脱离到培养容器中，在容器底部贴壁生长；此时培养基成分中，血清成分为FBS12～15％，培养基中使用非必须氨基酸1～2％，使用L谷氨酰胺1～2％，使用培养基中不使用抗生素、抗菌剂；

纯化：至生产开始的第10天至12天，通过显微操作，分离到Bayreuther FI表型的真皮成纤维细胞克隆，细胞接受离心力为380～420g；

重新接种：消化酶为胰蛋白酶，浓度为0.25mg/ml，作用时间为2～3分钟，温度是37℃；消化酶稀释分散的作用，Bayreuther FI表型的真皮成纤维细胞，全部漂浮，按20-25万个/cm2密度重新接种。反复培养-消化，得到细胞原料；此时培养基成分中，血清成分为FBS5～7％，，生产周期全程，培养基中使用非必须氨基酸1～2％，使用L谷氨酰胺1～2％，使用培养基中不使用抗生素、抗菌剂；

S3：细胞质检与放行：细胞质检在生产中期进行，约生产开始后第14天；此时，细胞已经经过纯化，经过第一轮稀释和培养面积的扩增，质检项目如下表1所示；

表1过程质检与放行检验项目表

表2细胞原料的放行标准如下表：

S4：细胞体外储存与使用：

S4.1：存储：细胞原料通过离心法，将细胞介质置换成含有二甲基亚砜的细胞冻存液，进行低温分装后，通过程序降温的方法，将细胞原料进行冷冻，冷冻后的细胞原料将长期储存在液氮蒸汽中，离心力380～420g；

S4.2：使用：细胞原料直接进入下一步制剂生产，通过离心重悬的方式，将细胞介质置换成其他溶液，制备成活细胞皮内注射液；