[发明专利]一种基因扩增实时荧光定量检测装置及检测方法

说明书

本发明公开了一种基因扩增实时荧光定量检测系统，涉及基因检测领域，包括：微流控检测管和加热模块，微流控检测管由透光材料制成且包括一凸出部；反应液进入微流控检测管后，填充到所述凸出部；加热模块设置有插入部；插入部包括用于通过激发光的激发光光路和用于通过发射光的发射光光路，激发光光路与发射光光路呈夹角；凸出部与插入部配合且表面相互接触；凸出部包括可位于光路中的凸出片；加热模块中还设置有用于加热的加热部件。本发明还公开了一种实时荧光定量检测方法，可以应用于PCR和恒温基因扩增检测中。本发明无需复杂的光路系统，即可实现荧光定量检测，还能精确控制温度，便于携带，扩展了应用场景。

技术领域

本发明涉及基因检测领域，尤其涉及一种基因扩增实时荧光定量检测装置及检测方法。

背景技术

基因检测可以对样品中的目标基因的特异序列进行扩增和检测，被应用于生物学研究、分子医学检测、犯罪现场分析以及农畜牧业检测等诸多方面。相较于传统的检测方法，基因扩增检测通常具有更高的灵敏度和特异性。最具有代表性的基因扩增检测方法是由美国科学家Kary Banks Mullis在1985年发明了聚合酶链反应(Polymerase ChainReaction,PCR)，即简易DNA扩增法。PCR通常包括三步反应：1)利用双链DNA在95摄氏度高温时变性成为单链；2)低温时(50-65摄氏度)，引物(primer)会与单链DNA按碱基互补配对原则结合；3)温度升高至聚合酶反应温度(通常为72摄氏度)，聚合酶沿5’至3’的方向合成与单链DNA的互部链。一个循环完成后，目标基因序列的数量理论上会增加为2倍，但实际增加的数量取决于反应的扩增效率，当扩增效率为100％时，每个循环基因的拷贝数增加为反应前的2倍。一个循环完成后，可以从第一步开始下一个热循环，完成对目标基因的指数型扩增。PCR扩增的特异性通常依赖于引物的设计和引物-单链DNA结合温度的设计。有些改进的PCR方法可以将第二步和第三步结合，从而省略了扩增温度控制步骤。因此，PCR方法要求在至少两个温度区间循环变化，并且对温度控制要求较为严格。这就要求PCR仪器的设备提供精确的温度控制。

实时荧光定量PCR通过在PCR反应体系中加入特定的荧光染料，在PCR扩增反应的过程中对荧光强度进行检测从而对样品中目标核酸的浓度进行定量的方法。通过对反应体系中荧光信号强度的增加，与一系列具有已知浓度的核酸样品对比，实时荧光定量PCR可以对样品中的目标基因进行定量。

荧光检测对光学系统有较严格的要求。通常需要激发光的波长与发射光的波长不相互干扰，这就需要添加不同的光学滤光片。在一些应用中，需要对同一反应中的荧光信号进行多通道的检测，即检测不同的激发光。在这些多通道的荧光检测中，也经常会使用不同的激发光。激发光滤光模块通常与发射光模块成对匹配。例如FAM通道，其激发光的波段为450-490nm，发射光的波段为510-530nm；再如Cy5通道，其激发光的波段为620-650nm，发射光的波段为675-690nm。此类多通道检测通常可以用来检测一个样品中的不同目标基因，或者用来检测样品和对照组(例如用作荧光矫正)。

恒温基因扩增是近年来发展的一种新型的基因扩增技术。其特点是基因扩增反应可以在一个恒定的温度完成，不再需要PCR反复的热循环步骤。恒温基因扩增也可与实时荧光系统相结合，进行基因的定量检测。

现有的用于实时荧光基因检测的系统存在以下缺陷：

1、需要精密的温度控制系统，尤其是对于PCR扩增反应，温度的准确性会很大程度的影响扩增的效率和特异性。

2、需要精密的荧光检测系统，尤其是多通道检测，通常需要精密机械装置调整光学模块。现有的实验室和临床使用的实时荧光定量PCR仪通常使用锥形管，联排管，孔板(例如96孔板或384孔板)。现有的检测通常经过锥形管、联排管、孔板的顶端进行检测，即激发光从顶端照射人锥形管、联排管、孔板中，产生的发射光也通过锥形管、联排管、孔板的顶端通过设定的光路和滤光原件到达接受检测光学元件(例如光电转换原件或相机等)。