[发明专利]一种来源于骨髓间充质干细胞外泌体-阿霉素纳米靶向药物的制备及体外抗骨肉瘤的研究

说明书

本发明公开一种来源于骨髓间充质干细胞外泌体‑阿霉素纳米靶向药物的制备及体外抗骨肉瘤的研究。包括如下步骤：（1）以无血清培养基培养BM‑MSC，并用外泌体提取试剂盒提取外泌体。（2）将外泌体与盐酸阿霉素按一定比例混合，加三乙胺脱盐，后将混合液置于透析袋4°C过夜制备外泌体‑阿霉素药物。（3）将制备的药物置于酶标仪，于490 nm处测量其吸收峰，计算药物的包载量。（4）将制备的药物用于体外抗骨肉瘤MG63细胞的疗效研究。本方法选择的MSC具有体内毒副作用小、低免疫原性、肿瘤靶向性及可体外大量扩增等优点，结合外泌体在体内广泛分布及具有归巢性的优点，其包载阿霉素后可有效地增强阿霉素对骨肉瘤细胞的杀伤作用。

技术领域

本发明涉及一种来源于骨髓间充质干细胞外泌体-阿霉素纳米靶向药物的制备方法及抗骨肉瘤的研究。

背景技术

药物载体是指天然或合成的高分子材料，以不同的形式与药物分子通过化学键结合、物理吸附或包裹，构成药物控制系统。纳米药物载体由于具有颗粒小，稳定性高及靶向性等优点，越来越受到研究者的重视。目前，有许多纳米材料被用来作为纳米药物载体，如纳米金颗粒、碳纳米管、纳米胶束及脂质体、聚合物纳米粒子等。在这些纳米载体中，基于脂质体的纳米载体由于具有良好的生物相容性及降解性、磷脂膜易突破质膜、容易将药物与周围环境分离以及能够与亲水和疏水的胶囊结合等优点而越来越被广泛应用。然而，尽管这些脂质纳米载体在疗效和靶向方面取得了巨大的成功，但其具有易引起宿主免疫系统的免疫排斥反应等缺点。为了克服这一缺点，天然的微粒如细菌、病毒、红细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、干细胞和外显子等，由于具有天然的倾向性，可高选择性及高效地进入靶细胞，近年来已被广泛开发用作药物传递载体。在所有这些天然微粒中，外泌体由于在生物流体中的广泛分布和固有的归巢能力，被认为是一种很有应用前景的天然微粒。

外泌体是一种直径在30-100nm之间的一种纳米膜囊，具有与质膜方向相同的双脂膜，能够携带蛋白质和遗传物质，在细胞间通讯中起着重要作用。其在生物体内广泛分布，具有内在的归巢能力及可穿透血脑屏障等优良性能，被认为是一种理想的药物载体。已知许多类型的细胞，如上皮细胞、造血细胞、肿瘤细胞和间充质干细胞（MSCS）等可分泌外体。在这些细胞中，间充质干细胞因具有良好的性能，如体外扩增能力强、肿瘤靶向性、低免疫原性和副作用，被认为是理想的可外体大规模生产外泌体的候选细胞。

下面所述为本发明人提出本研究利用来源于骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）的外泌体作为纳米载体，装载化疗药物阿霉素（DOX）用于骨肉瘤的治疗。与游离DOX相比，外泌体-DOX（Exo-Dox）具有较好的体外抗骨肿瘤作用。此外，这些BM-MSC外泌体对骨肉瘤细胞株无明显细胞毒性作用，这可能使其成为一种良好的肿瘤靶向药物纳米载体。

发明内容

本发明的目的是制备一种来源于骨髓间充质干细胞外泌体-阿霉素纳米靶向药物并用于体外抗骨肉瘤的研究。

为实现发明目的，本发明采用如下技术方案：

（1）骨髓间充质干细胞的培养：间充质干细胞生长到融合度70%-80%时，更换无血清培养基培养48个小时，接着收集其培养基用于外泌体的提取。

（2）外泌体的提取：将收集的培养基于4°C，3000g离心10分钟，用于清除细胞及细胞碎片；接着将外泌体提取试剂盒中的试剂按1:4的比例与培养基混合，涡旋震荡1分钟后常温放置2小时后，将混合液于4°C、10000g离心60分钟用于分离外泌体，将上清液吸干净后，每10mL培养基用100uL PBS重悬，然后将重悬液置于外泌体纯化柱中于4°C、3000g离心10分钟获取最终外泌体。

（3）外泌体-阿霉素纳米靶向药物的制备：将盐酸阿霉素粉末用无菌注射用水稀释至1mg/mL,接着将70ul 1mg/mL的外泌体与930ul 1mg/mL盐酸阿霉素混合，静置30分钟后，加三乙胺去盐，常温放置60分钟后将混合液移至透析袋，于4°C过夜，计算其包载量和释放度。