[发明专利]一种基因工程菌湿细胞的收集与保存方法

说明书

本发明公开了一种基因工程菌湿细胞的收集与保存方法，属于生物工程技术领域。利用本发明的方法对共表达苏氨酸脱氨酶、甲酸脱氢酶和亮氨酸脱氢酶的大肠杆菌进行湿细胞收集与保存，湿菌体保存2个月后，利用解冻后湿细胞转化生产L‑2‑氨基丁酸，底物L‑苏氨酸转化率达到96.8％，三种酶的相对于新鲜湿细胞的酶活均能达到90.0％以上。

技术领域

本发明涉及一种基因工程菌湿细胞的收集与保存方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

L-2-氨基丁酸(L-ABA)是一种非天然氨基酸，作为一种重要的化工原材料和手性医药中间体，目前已广泛应用于抑菌抗结核药物盐酸乙胺丁醇、新型抗癫痫药物左乙拉西坦和布瓦西坦等药物合成领域。

目前，已被报道的L-ABA的合成方法包括化学法和生物法。化学法主要包括酮丁酸还原法、脱硫反应法等，化学法易形成消旋体，不利于手性化合物的合成，并且反应条件严苛，试剂成本高，环境污染严重，不易进行工业化生产。

生物法因其反应条件温和、立体选择性高和绿色环保等特点受到广泛的关注。酶法主要利用苏氨酸脱氨酶(L-TD)、亮氨酸脱氢酶(LDH)，偶联甲酸脱氢酶(FDH)或葡萄糖脱氢酶(GDH)，以L-苏氨酸为底物合成L-ABA，同时FDH或GDH实现辅酶NADH的循环。国外较早开展了利用氨基酸脱氢酶转化生产L-ABA的工作。1997年Galkin等以2-酮丁酸为底物，通过偶联T.intermedius来源的亮氨酸脱氢酶(LDH)和NADH循环再用酶甲酸脱氢酶(FDH)，最终获得36g/L的L-ABA，产物得率为88％，但底物2-酮丁酸不稳定且价格高。2014年Tao等在大肠杆菌中分别表达L-TD、LDH和FDH，在30L转化体系中将30mol L-苏氨酸转化为29.2mol L-ABA，产率为97.3％，时空产率达到了6.37g/(L·h)。2018年张蔡喆构建两株分别表达TD和共表达LDH/GDH的重组大肠杆菌，在此基础上构建了一种以L-苏氨酸和D-葡萄糖为底物联产L-ABA和D-葡萄糖酸的全细胞转化系统，采用分批补料策略，最终转化得到141.6g/L的L-ABA和269.4g/L的D-葡萄糖酸，该方法转化效果较好，但是需要添加两种菌体、两种底物，分离两种产物，增加了工艺的复杂性。

发明人前期利用双质粒的重组菌株共表达了L-TD、LDH和FDH，实现添加单一菌株，全细胞转化L-苏氨酸生产L-ABA(专利公开号：CN109266595A)，简化了生产工艺。在实际应用过程中，发酵收集的菌泥需要保藏后解冻用于转化实验，收集与储存的方式会影响酶活，进而影响转化效果。如在较低温度时，FDH会因为游离的巯基被氧化而失活。因此，提供一种高效、低成本、易于放大、减少保藏过程中酶活损失的全细胞收集与保存的方法，对于实现酶法工业化生产有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基因工程菌株湿细胞的收集与保存方法，是将基因工程菌株的发酵液降温至4～15℃，加入50～100mmol/L半胱氨酸和/或5～20μmol/L辅酶磷酸吡哆醛，混匀后6000～8000rpm离心5～10min获得湿细胞；所述基因工程菌株以大肠杆菌为宿主，共表达苏氨酸脱氨酶、甲酸脱氢酶和亮氨酸脱氢酶。

本发明的一种实施方式中，离心温度为4～15℃。

本发明的一种实施方式中，收集的湿细胞菌泥的含水量为75％～80％。

本发明的一种实施方式中，将工程菌株置于-10～-20℃冷冻保存。

本发明的一种实施方式中，基因工程菌株需分批保存，不能反复冻融。

本发明的一种实施方式中，所述工程菌株用于转化实验时，加入3.5-4.5倍体积15～25℃去离子水，自然解冻或25～50rpm低速搅拌解冻。

本发明的一种实施方式中，所述苏氨酸脱氨酶来源于大肠杆菌Escherichia coliW3110，基因序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。