[发明专利]一种通过CRISPR系统对真菌基因组进行多轮编辑的系统及其方法

权利要求书

1.一种基于CRISPR-Cas系统对丝状真菌基因组的多轮基因编辑方法，其特征在于，包括下述步骤：

1）基因组的第一轮编辑：在目的丝状真菌基因组中导入第一组编辑系统，完成目的真菌基因组的第一轮编辑，所述第一组编辑系统包括Cas核酸酶的表达框、第一组同源供体DNA序列、及其相应的第一组引导RNA的表达元件，其中第一组同源供体DNA包括一个或多个针对不同基因进行编辑的相应的同源供体DNA序列，且仅一个供体同源供体DNA含有第一标记基因；其中，针对靶标基因的编辑是采用同源重组修复机制，即在编辑的DNA位点两侧添加同源臂，实现本轮同源供体DNA序列的精确整合到靶标基因的切割位点；

2）对上述经过第一轮编辑的工程菌细胞导入第二组编辑系统，完成目的真菌基因组的第二轮编辑，所述第二组编辑系统包括Cas核酸酶的表达框、第二组同源供体DNA序列、及其相应的第二组引导RNA的表达元件，其中第二组同源供体DNA包括一个或多个针对不同基因进行编辑的相应的同源供体DNA序列，且仅一个同源供体DNA含有第二标记基因；其中，第二标记基因与第一标记基因不同；

其中，对第一轮引入的第一标记基因的敲除编辑是采用同源重组修复机制，即在编辑的DNA位点两侧添加同源臂，实现同源供体DNA序列的精确整合到第一标记基因位点，对第一标记基因的DNA序列进行全部缺失敲除；针对靶标基因的编辑同样采用同源重组修复机制，即在编辑的DNA位点两侧添加同源臂，实现本轮同源供体DNA序列的精确整合到靶标基因的切割位点；所述Cas核酸酶的表达框是Cas12a或Cas9基因的表达框。

2.如权利要求1所述的多轮基因编辑方法，其特征在于，还包括下述步骤：

3）进一步包括第三轮基因编辑步骤，对第二轮编辑的工程菌基因组中继续导入第三组编辑系统，完成目的真菌基因组的第三轮编辑，所述第三组编辑系统包括Cas核酸酶的表达框、第三组同源供体DNA序列、及其相应的第三组引导RNA的表达元件，其中第三组同源供体DNA包括一个或多个针对不同基因进行编辑的相应的同源供体DNA序列，且仅一个供体同源供体DNA含有第三标记基因，其中第三标记基因不同于第二标记基因，与第一标记基因相同或不同；其中，对第二轮引入的第二标记基因的敲除编辑是采用同源重组修复机制，即在编辑的DNA位点两侧添加同源臂，实现同源供体DNA序列的精确整合到标记基因的切割位点，对第二标记基因的DNA序列进行全部缺失敲除。

3.如权利要求2所述的多轮基因编辑方法，其特征在于，再次重复第2）步，或顺序进一步重复第3）步，所述重复顺次交替一次或多次，其中相邻步骤中采用的标记基因不相同。

4.如权利要求2所述的多轮基因编辑方法，其特征在于，在某一轮中需要过表达某基因，则对靶标基因的编辑采用同源重组修复机制，在所述需要过表达基因DNA序列的两侧添加同源臂，实现过表达DNA序列的精确整合到靶标基因的切割位点。

5.如权利要求3所述的多轮基因编辑方法，其特征在于，采用两个标记基因交替使用，每步中采用的引导RNA的表达元件和同源供体DNA序列根据待编辑的基因设计。

6.如权利要求4所述的多轮基因编辑方法，其特征在于，其中某一轮针对多个不同基因进行编辑时，所述相应组的引导RNA的表达元件分别制备相应于不同基因的多个引导RNA的表达元件，或者其中部分引导RNA的表达元件串联，或者全部引导RNA的表达元件串联成一条引导RNA的表达元件。

7.如权利要求1所述的多轮基因编辑方法，其特征在于，所述Cas12a基因的表达框是含有嗜热毁丝霉转录因子HACI核定位信号序列和SV40 NLS核定位信号序列。

8.如权利要求7所述的多轮基因编辑方法，其特征在于，所述Cas12a基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

9.如权利要求8所述的多轮基因编辑方法，其特征在于，所述Cas12a基因的表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。