[发明专利]一种基于质谱的完整N-糖肽相对定量方法有效
| 申请号： | 201910460317.6 | 申请日： | 2019-05-30 |
| 公开（公告）号： | CN110261500B | 公开（公告）日： | 2021-05-11 |
| 发明（设计）人： | 田志新;连浩志;王悦;肖开捷 | 申请（专利权）人： | 同济大学 |
| 主分类号： | G01N30/02 | 分类号： | G01N30/02;G01N30/08 |
| 代理公司： | 上海科盛知识产权代理有限公司 31225 | 代理人： | 褚明伟 |
| 地址： | 200092 *** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 基于 完整 糖肽 相对 定量 方法 | ||
1.一种基于质谱的完整N-糖肽相对定量方法，其特征在于，包括以下步骤：培养正常生理体系和患病体系的细胞，提取两种细胞体系的全部蛋白质组，富集两种细胞的完整N-糖肽，使用同位素酯化反应对完整N-糖肽C端进行标记，使用同位素二甲基标记技术对完整N-糖肽N端进行标记，将两种标记后的完整N-糖肽1:1混合，使用RPLC-MS/MS进行检测，使用GPSeeker数据库搜索软件进行数据分析；
在完整N-糖肽的C端使用酯化反应进行同位素标记时，其中，正常生理体系完整N-糖肽的C端使用CH3CH2CH2OH试剂进行标记，患病体系的C端使用(CD3)2CHOH试剂进行标记；
在完整N-糖肽的N端通过控制反应体系的pH值实现只对N端的二甲基标记，对于正常体系完整N-糖肽使用DCDO试剂和NaBD3CN试剂进行同位素标记，对于患病体系完整N-糖肽使用HCHO和NaBH3CN进行标记；
每种同位素标签标记后都会使分子量增加6 Da，并且在两种标签中都引入了相同数量的D，等重标记中，成对的肽骨架N-端碎片离子和C-端碎片离子能够独立进行相对定量或同时使用进行更加准确的相互验证相对定量；
使用RPLC-MS/MS进行检测时，在液相色谱中两种体系的完整N-糖肽同时洗脱，两种体系的完整N-糖肽同时进入质谱进行检测，通过二级质谱的b/y离子进行相对定量；
使用Trypsin酶切细胞的蛋白质，zic-HILIC富集细胞的完整N-糖肽。
2.根据权利要求1所述的一种基于质谱的完整N-糖肽相对定量方法，其特征在于，1:1混合指：按照正常生理体系和患病体系标记后完整N-糖肽的重量、体积或摩尔量以1:1比例进行混合。
3.根据权利要求1所述的一种基于质谱的完整N-糖肽相对定量方法，其特征在于，经过同位素酯化反应、同位素二甲基标记技术对完整N-糖肽进行标记后，两种体系的完整N-糖肽具有相同的分子量。
4.根据权利要求1所述的一种基于质谱的完整N-糖肽相对定量方法，其特征在于，使用GPSeeker数据库搜索软件进行数据分析是指：对采集到的质谱数据进行定性和定量搜索，找出患病体系相对于正常体系差异表达的完整N-糖肽，获得其结构信息。
5.根据权利要求1所述的一种基于质谱的完整N-糖肽相对定量方法，其特征在于，蛋白质提取后，还原、烷基化、天冬氨酸及谷氨酸酯化保护，再使用Trypsin酶切细胞的蛋白质，zic-HILIC富集细胞的完整N-糖肽。
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