[发明专利]脐带间充质干细胞MSCs及其培养方法和应用

权利要求书

1.一种脐带间充质干细胞MSCs的培养方法，其特征在于，包括MSCs培养步骤，所述MSCs培养步骤包括以下步骤：

原代培养：取脐带的华通胶组织，以无血清培养基在低氧条件下培养，直至达到传代标准；所述传代标准为长至80-90％融合度；

传代培养：收集上述P1原代细胞，去除残留培养基，制得单细胞悬液，离心获得细胞沉淀；向该细胞沉淀中加入无血清培养基，在低氧条件下培养至传代，连续培养到P2-P3代；随后每次传代培养时加入盐酸川芎嗪和参麦注射液，待细胞长至预定融合度时，消化、收集细胞，所述盐酸川芎嗪的加入量为浓度为40-80mg/L，所述参麦注射液的加入体积百分数为0.5％；加入盐酸川芎嗪和参麦注射液后继续培养传代至P4-P6代；

表型检测：对上述收集得到的细胞进行表型检测，符合CD31、HLA－DR、CD34和CD45阴性，CD44、CD73、CD90和CD105阳性的细胞为目标MSCs细胞，待用；

所述MSCs培养步骤中，所述低氧条件为：在氧浓度3-10％的二氧化碳培养箱中培养；所述无血清培养基选自：间充质干细胞无血清培养基，或在DMEM、F12、DMEM/F12、RPMI1640基础培养基的基础上添加细胞因子所得到的培养基。

2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞MSCs的培养方法，其特征在于，在所述MSCs培养步骤之前，还包括如下MSCs制备步骤；在所述MSCs培养步骤之后，还包括如下质量控制步骤；

所述MSCs制备步骤为：采集剖腹产所得脐带组织，冷藏运输，且确保样本未经高能射线辐照，清洗，剥离组织中血管，取得组织中的华通胶组织；

所述质量控制步骤为：对获得的目标MSCs进行细胞鉴别及纯度检测、细胞生长活性检测、细菌及支原体检测、内毒素检测、外源性致病因子检测、异常免疫性反应检测、致瘤性检测和/或添加成分残余量检测。

3.根据权利要求2所述的脐带间充质干细胞MSCs的培养方法，其特征在于，所述MSCs制备步骤之前，还包括如下供者筛查步骤：

1)供者于样本采集前做烈性传染病检测，所述烈性传染病包括：艾滋病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、梅毒螺旋体、巨细胞病毒、EB病毒、吞噬T细胞病毒，上述烈性传染病均为未曾感染为合格；

2)供者于样本采集前做遗传病DNA基因检测，所述遗传病包括：软骨发育不全、先天性耳聋、抗维生素D佝偻病、苯丙酮尿症、血友病、进行性肌营养不良、6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏，上述传染病均为阴性为合格；

3)供者于样本采集前3个月期间内未曾前往或停留疫区；

同时符合上述条件即为合格供者。