[发明专利]一种无外源蛋白干扰的ELISA标准品的制备方法

说明书

本发明是一种无外源蛋白干扰的ELISA标准品的制备方法，属诊断试剂技术领域，包括以下步骤：a.配制冻存液基础液：配制三羟甲基氨基甲烷‑盐酸缓冲溶液（Tris‑HCl）的缓冲液摩尔浓度为0.05‑0.1 mol/L，调节pH至7.2‑7.4；缓冲液中依次加入2%甘露醇，5%‑10%海藻糖，0.05%‑0.1%Tween 20或0.05%‑0.1%Tween 80，0.03%‑0.05%proclin300得到冻干基础液；b.向冻干基础液中加入0%‑2%人重组白蛋白HSA，得到冻干工作液；c.将需要冻干的蛋白用冻干工作液稀释至需要准备的浓度；d.将上述标准蛋白加到玻璃瓶中，盖上橡胶塞并留空隙，然后至‑80度预冻4h以上，然后至冷冻干燥机冻干12小时以上，使用本发明得到的冻干品可以有效的保护极低浓度的标准品蛋白，4度4年以上，并且不会带来外源蛋白的干扰。

技术领域

本发明提供一种ELISA试剂盒的标准品制备方法，属于生物体外诊断试剂技术领域。

背景技术

酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是由瑞典学家Peter Perlmann 和Eva Engvall于1971年建立，由于其具有特异、灵敏、简便、快速的特点，现已在生物医学研究领域及临床疾病的诊疗中得到了广泛的应用。

市面上的ELISA标准品有液体和冻干品两种形式，在《蛋白纯化指南》有讲明蛋白保护可以从以下方面：高浓度的甘油、加入稳定性基质, 甚至加入其他蛋白质 (如血清白蛋白）有利于提高蛋白质的长期稳定性。但是这些大部分是指在蛋白质浓度比较高的情况，市面上常见的蛋白商品浓度一般在ug/mL浓度，在加入高浓度的甘油时，蛋白浓度一般在ug/mL时活性通常可保持 6 个月至 1 年。由于ELISA标准品的含量一般在ng级别，有的甚至在pg级别，因此能找到一种能长期稳定ELISA标准品的方法，成了制约ELISA试剂盒应用的关键因素。

同时，为了维持蛋白的稳定性，在蛋白的保护剂中，常加入无关蛋白比如牛血清白蛋白BSA，是被使用的最广泛的一种方法，但是我们知道牛血清白蛋白从牛的血清中分离而来，不仅存在朊蛋白等病原物生物危险存在，同时因为其存在些无关其他细胞因子或自身抗体，也会带来对检测结果的干扰，因为在我们实际研发的过程中，发现这种种属干扰存在，严重影响了ELISA试剂盒的应用中，检测的常见种属有人，小鼠，大鼠，牛等，而这些种属间的许多蛋白具有同源性高，相识度大的特点，特别是在包被抗体，或检测抗体是多抗的情况下，这种情况更普遍。而我们创造性的加入重组的HSA蛋白代替传统加入BSA这种方式，由于提高检测结果的准确性，确保无其他蛋白的干扰结果的测定。

由于Tris-HCl缓冲液具有以下优点：①因为Tris碱的碱性较强，所以可以只用这一种缓冲体系配制pH范围由酸性到碱性的大范围pH值的缓冲液；②对生物化学过程干扰很小，不与钙、镁离子及重金属离子发生沉淀，因此我们还比较了Tris-Hcl缓冲液和磷酸盐缓冲液的区别，通过ELISA的标曲曲线变化确定了冻存蛋白比较合适的实验方案。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能使 ELISA 标准品在4 度保存4年以上，蛋白活性稳定更好，无病原物生物危险，无外源蛋白干扰的ELISA 标准品的制备方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是该 ELISA 标准品的制备方法包括以下步骤 ：

1. 一种 ELISA 标准品的制备方法，其特征在于包括以下步骤 ：