[发明专利]系统性硬化症诊断的脂肪酸代谢物分析检测方法

权利要求书

1.一种系统性硬化症诊断的脂肪酸代谢物分析检测方法，其特征在于：样品预处理后，采用超高效液相色谱UHPLC进行分离，色谱条件为：柱温25℃；流速0.3mL/min；进样量2μL；流动相组成A：水+25mM乙酸铵+25mM氨水，B：乙腈；梯度洗脱程序如下：0-1min，95％B；1-14min，B从95％线性变化至65％；14-16min，B从65％线性变化至40％；16-18min，B维持在40％；18-18.1min，B从40％线性变化至95％；18.1-23min，B维持在95％；自动进样器4℃；为避免仪器检测信号波动而造成的影响，采用随机顺序进行样本的连续分析，样本队列中插入质控QC样品，用于监测和评价系统的稳定性及实验数据的可靠性；样品经超高效液相色谱UHPLC分离后用质谱仪Q-TOF进行质谱分析，Q-TOF质谱条件为：分别采用电喷雾电离ESI正离子和负离子模式进行检测。

2.根据权利要求1所述的系统性硬化症诊断的脂肪酸代谢物分析检测方法，其特征在于：样品预处理步骤为：-80℃取样本，在4℃环境下缓慢解冻后，分别取各组样本100ul后加入400ul预冷甲醇/乙腈溶液涡旋混合，其中甲醇：乙腈＝1:1(v/v)，-20℃静置60min，14000g4℃离心20min，取上清真空干燥。

3.根据权利要求1所述的系统性硬化症诊断的脂肪酸代谢物分析检测方法，其特征在于：所述的色谱柱为Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色谱系统HILIC色谱柱；质谱仪为Triple TOF 5600质谱仪。

4.根据权利要求1所述的系统性硬化症诊断的脂肪酸代谢物分析检测方法，其特征在于：质谱分析时，样品加入100μL乙腈水溶液复溶，其中乙腈：水＝1:1(v/v)，涡旋，14000g4℃离心15min，取上清液进样分析。

5.根据权利要求1所述的系统性硬化症诊断的脂肪酸代谢物分析检测方法，其特征在于：每个待测样本等量混合用于制备质控QC样本，用于测定进样前仪器状态及平衡色谱-质谱系统，并用于评价整个实验过程中系统稳定性，剩余待测样进行色谱-质谱检测。

6.根据权利要求1所述的系统性硬化症诊断的脂肪酸代谢物分析检测方法，其特征在于：原始数据经ProteoWizard转换成.mzXML格式，然后采用XCMS程序进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积，代谢物结构鉴定采用精确质量数匹配<25ppm和二级谱图匹配的方式，检索实验室自建数据库，对XCMS提取得到的数据，删除组别总和>2/3的离子峰。

7.根据权利要求6所述的系统性硬化症诊断的脂肪酸代谢物分析检测方法，其特征在于：应用软件SIMCA-P14.1，Umetrics，Umea，Sweden，进行模式识别，数据经Pareto-scaling预处理后，进行多维统计分析。

8.根据权利要求7所述的系统性硬化症诊断的脂肪酸代谢物分析检测方法，其特征在于：所述多维统计分析包括无监督主成分分析PCA，有监督偏最小二乘法判别分析PLS-DA和正交偏最小二乘法判别分析OPLS-DA，单维统计分析包括Student’s t-test和变异倍数分析，R软件绘制火山图；以VIP>1为筛选标准，初步筛选出各组间的差异物。

9.根据权利要求8所述的系统性硬化症诊断的脂肪酸代谢物分析检测方法，其特征在于：采用单变量统计分析，验证差异代谢物是否具有显著性，选择同时具有多维统计分析VIP>1和单变量统计分析P value<0.05的代谢物，作为具有显著性差异的代谢物；而VIP>1且0.05<P value<0.1则作为差异代谢物。