[发明专利]基于LC-MS/MS前衍生化测定人血浆中利塞膦酸的方法及其应用

说明书

本发明涉及到基于LC‑MS/MS前衍生化测定人血浆中利塞膦酸的方法。该方法的前衍生化步骤为：取血浆样本150μL，加入5.00μL内标工作液，混匀，加入150μL10％三氯乙酸，振荡3min后，13000rpm离心5min，取上清100μL加57.0μL甲醇‑25％氨水(50∶7，v/v)，振荡3min；然后加入400μL三甲基硅烷基重氮甲烷，1600rpm振荡衍生4h，静置后取下层溶液2.00μL进样。与现有技术相比，本发明通过蛋白沉淀后直接进行衍生化反应，极大程度地简化了利塞膦酸的样本前处理过程，具有运行时间短、选择性好、灵敏度高的优点。

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，涉及到基于LC-MS/MS前衍生化测定人血浆中利塞膦酸的方法及其应用。

背景技术

利塞膦酸(Risedronate，图1)是一种双膦酸类化合物，可抑制破骨细胞活化，阻止估值溶解，临床上主要用于治疗和预防绝经后妇女的骨质疏松症。双膦酸盐药物按化学结构可分为三代，第一代双膦酸盐的代表药物是依替膦酸和氯屈膦酸；第二代双膦酸盐在其侧链引入氮原子，代表药物有帕米膦酸、阿伦磷酸和奈立膦酸；第三代则具有环状侧链，代表药物有利塞膦酸和唑来膦酸。依替膦酸(A)、氯屈膦酸(B)、帕米膦酸(C)、阿伦磷酸(D)、奈立膦酸(E)、利塞膦酸(F)和唑来膦酸(G)的结构式如下所示。

双膦酸盐类化合物结构中含有两个膦酸基团，其特殊的结构使得分析测试具有很大的挑战性。双膦酸类化合物极性大，使得该类化合物在普通的HPLC色谱柱上难以保留，并容易产生基质效应。大多数双膦酸盐是非挥发性化合物，且结构中缺少紫外或荧光发色团，进一步限制了气相色谱及液相-紫外或荧光检测的直接应用。

目前文献报道主要采用固相萃取结合衍生化的方法测定双膦酸类药物在生物样本中浓度。如Zhu等建立了重氮甲烷衍生化LC-MS/MS测定人血清和尿中阿仑膦酸和利塞膦酸，在固相萃取柱上进行衍生化，但衍生化试剂重氮甲烷不稳定，操作难度大；Chen等在此基础上采用较安全的三甲基硅重氮甲烷代替重氮甲烷作为衍生化试剂，建立了固相萃取柱上衍生化测定阿仑膦酸在人体内的血药浓度；Yang等按照相同的处理对米诺膦酸的药动学进行了研究。

这些方法均需要采用固相萃取的方法，并在柱上或柱后对双膦酸类化合物进行衍生化反应，但该方法受固相萃取柱的限制，需要采用相应的阴离子和阳离子交换柱，不但价格昂贵，而且在实际的操作过程中，因为柱上pH的影响，会不同程度地影响衍生化效率，导致方法在不同实验室之间的重现性差，影响了双膦酸药物的进一步开发。

发明内容

本发明依据文献报道采用三甲基硅重氮甲烷作为衍生化试剂对利塞膦酸进行测定，在对衍生化条件进行系统优化的基础上，建立一个耐用的衍生化LC-MS/MS法测定人血浆中的利塞膦酸，并将其应用于双膦酸类化合物的药动学研究。

本发明所述的基于LC-MS/MS前衍生化测定人血浆中利塞膦酸的方法，具体步骤为：

(1)衍生化

取血浆样本150μL，加入内标工作液，混匀，加入100-200μL的8-12％三氯乙酸，振荡1-10min后，8000-20000rpm离心1-15min，取上清100μL加0.1-0.7倍量的甲醇∶氨水＝50∶7，振荡1-10min；然后加入200-600μL三甲基硅烷基重氮甲烷，1000-5000rpm振荡衍生1-10h，静置后取下层溶液进样LC-MS/MS分析；

(2)质谱条件