[发明专利]基于LC-MS/MS前衍生化测定人血浆中利塞膦酸的方法及其应用

权利要求书

1.一种基于LC-MS/MS前衍生化测定人血浆中利塞膦酸的方法，其特征在于，具体步骤为：

(1)衍生化

取血浆样本150μL，加入内标工作液，混匀，加入100-200μL的8-12％三氯乙酸，振荡1-10min后，8000-20000rpm离心1-15min，取上清100μL加0.1-0.7倍量体积的甲醇∶氨水＝50∶7，振荡1-10min；然后加入200-600μL三甲基硅烷基重氮甲烷，1000-5000rpm振荡衍生1-10h，静置后取下层溶液进样LC-MS/MS分析；

(2)质谱条件

离子源为电喷雾电离源；源喷射电压为5000-6000V；温度为500-600℃；以N₂为离子源气体1，压力为50-70psi；以N₂为离子源气体2，压力为60-80psi；以N₂为气帘气体，压力为20-30psi；正离子方式检测；去簇电压为60-80V；扫描方式为多反应监测，碰撞能量均为25-40eV；用于利塞膦酸衍生化产物及内标利塞膦酸-D4衍生化产物定量分析的离子反应分别为m/z 354.2→m/z 228.1和m/z 358.2→m/z 232.1；碰撞活化解离为4-8；扫描时间为40-60ms。

2.根据权利要求1的基于LC-MS/MS前衍生化测定人血浆中利塞膦酸的方法，其特征在于，具体步骤为：

(1)衍生化

取血浆样本150μL，加入5.00μL内标工作液，混匀，加入150μL10％三氯乙酸，振荡3min后，13000rpm离心5min，取上清100μL加57.0μL甲醇-25％氨水(50∶7，v/v)，振荡3min；然后加入400μL三甲基硅烷基重氮甲烷，1600rpm振荡衍生4h，静置后取下层溶液2.00μL进样LC-MS/MS分析；

(2)质谱条件

离子源为电喷雾电离源；源喷射电压为5500V；温度为550℃；以N₂为离子源气体1，压力为60psi；以N₂为离子源气体2，压力为70psi；以N₂为气帘气体，压力为25psi；正离子方式检测；去簇电压为70V；扫描方式为多反应监测，碰撞能量均为32eV；用于利塞膦酸衍生化产物及内标利塞膦酸-D4衍生化产物定量分析的离子反应分别为m/z 354.2→m/z 228.1和m/z358.2→m/z 232.1；碰撞活化解离为6；扫描时间为50ms。

3.根据权利要求1的基于LC-MS/MS前衍生化测定人血浆中利塞膦酸的方法，其特征在于，液相条件为；色谱柱为Shim-packGIST-HPC18柱(50×2.1mm，3μm粒径)；流动相A相为10mM乙酸铵水溶液(含0.5％甲酸)，B相为甲醇，流速为0.4mL/min，采用梯度洗脱程序，流动相A变化过程为：0-0.4min，95-95％；0.4-1.4，95-75％；1.4-2.2，75-75％；2.2-2.3，75-10％；2.3-3.1，10-10％；3.1-3.2，10-95％；3.2-4.5，95-95％。

4.根据权利要求1的基于LC-MS/MS前衍生化测定人血浆中利塞膦酸的方法，其特征在于，血浆样本制备过程为：采集肘静脉血5mL至K₂-EDTA抗凝的真空采血管中，每次采血前需弃血1.0mL，然后立即于2～8℃下离心10min，离心力1500×g，分离血浆，于-70℃冰箱中冷冻。