[发明专利]一种无自切形式的微纤溶酶制备方法

说明书

本发明提出了一种无自切形式的微纤溶酶制备方法，包括步骤有：S1、无自切方式人微小纤溶酶的重组发酵；步骤S1中包含步骤：S12、液体发酵培养，在液体发酵培养过程中加入(NH4)2SO4和蔗糖。无自切形式的微纤溶酶制备方法解决现有技术中不能既避免因pH过低导致微纤溶酶酸水解同时又避免因pH值过高而导致微纤溶酶的自身催化降解的问题。

技术领域

本发明涉及酶制备方法，具体涉及一种无自切形式的微纤溶酶制备方法。

背景技术

纤维蛋白溶解酶（纤溶酶）是一种来自纤溶酶原的丝氨酸蛋白酶，纤溶酶原是哺乳动物血液的重要成分。人纤溶酶原( Plasminogen，Plg) 是由791个氨基酸残基组成的多结构域蛋白，由N端活化前结构域、5个同源的Kringle结构域（每个大约80个氨基酸）、一个丝氨酸蛋白酶催化结构域和结构域间的连接序列组成，分子量大约为92000道尔顿，是人体纤溶系统的关键成分之一，用纤溶酶切割人纤溶酶原N端Arg68-Met69，或Lys77-Lys78或者Lys78-Val79之间的肽键，产生缩短的酶原，称为赖氨酸-纤溶酶原。由弹性蛋白酶进一步切割去除前4个Kringle结构域，产生另一个酶原，小纤溶酶原（通常是442-791位氨基酸），进一步切掉第五个Kringle，得到微小纤溶酶原（通常是543-791位氨基酸）。纤溶酶原的Kringle区域含有赖氨酸结合位点，它们介导纤溶酶原与底物如纤溶蛋白的特异性结合，在Arg561与Val562之间的肽键进行切割，使纤溶酶原的酶原形式活化为它们具有酶活的形式，产生与相应蛋白质的由二硫键连接的双链形式，纤溶酶原蛋白活化的产物被称为纤溶酶，因此Lys-纤溶酶原活化的产物称为Lys-纤溶酶，而小纤溶酶原和微小纤溶酶原活化后的产物被称为小纤溶酶和微小纤溶酶。纤溶酶(Plasmin，Plm)，不仅发挥纤溶作用，溶解血栓，而且参与体内一系列与蛋白质水解有关的生理、病理过程。由于Plg分子量很大且非常柔韧，难以获得完整晶体，故其精确结构的确定受到限制，影响了结构和功能的深入研究。

人微小纤溶酶原（microplasminogen，mPlg）是Plg 543～791位间的249个氨基酸组成的肽链，有6对二硫键，不包括Plg的NTP、K1～K5 区，但保留了纤溶酶原的丝氨酸蛋白酶（SP）区，被纤溶酶原激活剂激活后（将Arg19-Val20切断）形成人微小纤溶酶（微纤溶酶，Ocriplasmin又称microplasmin，mPlm），具有Plm的纤溶活性。mPlm包含两条多肽链，一条重链A通过两条二硫键与一条轻链B相连，A链与B链之间由两对二硫键相连接，这对二硫键对活性中心的形成十分重要，B链包含丝氨酸蛋白酶催化结构，纤溶酶在体内能够溶解血凝块，显示其丝氨酸蛋白酶催化活性，特征结构图为图一。

第一种将Ocriplasmin用于临床的药物是ThromboGenics研发的Jetrea。2012年10月 18日，美国食品药品管理局 (FDA)和 ThromboGenics宣布，已批准 Jetrea(Ocriplasmin)用于治疗症状性玻璃体黄斑粘连(VMA，是一种年龄相关性玻璃体后脱离(PVD)，即后玻璃体与内限制膜分离不完全的情况)。Jetrea是首个获得该适应证的药物。Ocriplasmin可降解眼中参与VMA发生的蛋白质。这些蛋白质的降解有助于玻璃体与黄斑的分离。该病的另一种治疗选择是玻璃体切除术。

Ocriplasmin能够降解构成血栓的主要成分—纤维蛋白，治疗血栓方面有着显著的疗效，以及相对较小的副作用。Ocriplasmin在眼睛内具有降解连接玻璃体和视网膜的蛋白质支架的潜力。这可能有助于治疗一些重要的眼科适应症，如症状性玻璃体粘连。

纤溶酶原或纤溶酶存在一些获取和应用障碍，人纤溶酶原分子量较大，利用一些宿主细胞如大肠杆菌、哺乳动物细胞等表达较困难，表达效率比较低；而且人纤溶酶的分子量较大，使其作为药物进行治疗机体疾病时扩散较慢，影响疗效。重组人纤溶酶原或人纤溶酶的截短形式（Ocriplasmin）能够从一定程度上解决以上所述困难。有研究报道使用人微纤溶酶用于治疗眼部疾病，或作为玻璃体切除术的辅助药物，在玻璃体的注射位置向玻璃体视网膜接触面的扩散不会受到太大阻碍(CN 100577202C)。