[发明专利]一种基于流式细胞术检测鸡脾脏CD8+

说明书

本发明涉及一种基于流式细胞术检测鸡脾脏CD8⁺T细胞特异性杀伤作用的方法，包括如下步骤：（1）细菌培养，所述的细菌为鸡白痢沙门菌S06004和S06004ΔspiC；（2）鸡的免疫及采样；（3）靶细胞—巨噬细胞的制备；（4）效应细胞—鸡脾脏CD8⁺T细胞的制备：包括鸡脾脏淋巴细胞悬液的制备步骤和磁珠分选鸡脾脏CD8⁺T细胞的步骤；（5）CTL特异性杀伤巨噬细胞。相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：本发明贴壁获得的巨噬细胞（靶细胞）纯度较高，且鸡脾脏CD8⁺T细胞分选效果明显，分离时间短；以沙门菌宿主细胞—巨噬细胞作为靶细胞，可更精确反映宿主对沙门菌的清除能力；将流式细胞术用于鸡脾脏CD8⁺T细胞特异性杀伤作用，可在单细胞水平检测鸡脾脏CD8⁺T细胞的CTL效应。

技术领域

本发明涉及一种基于流式细胞术检测鸡脾脏CD8⁺T细胞特异性杀伤作用的方法。

背景技术

细胞免疫应答是由T淋巴细胞介导，有利于促进机体抗体的产生，也有助于清除寄生于胞内的病原微生物（如细菌、病毒等）。另外，细胞免疫应答在家禽免疫监视及抗肿瘤（如马立克氏病）免疫过程中也具有重要作用。家禽被病原微生物感染后，T细胞通过产生促炎性细胞因子、调节局部和全身免疫应答、活化巨噬细胞以及清除胞内细菌等，在免疫应答过程中发挥着至关重要的作用。其中，细胞毒性T细胞（CTL）具有溶解活性，在对异常细胞（如肿瘤和病原感染的细胞）的识别和清除中起关键作用，主要通过穿孔素/颗粒酶、死亡受体这两种途径杀伤靶细胞，因此，细胞毒活性的测定在基础理论研究和生产实践中均具有重要意义。

目前存在较多检测细胞毒性的方法：MTT还原法、LDH释放法、报告基因转染法、ELISPOT试验和放射性铬（⁵¹Cr）释放测定等。其中，评估细胞毒性最流行的检测方法是放射性铬（⁵¹Cr）释放测定，该方法被认为是检测细胞介导的细胞毒性的“金标准”，具有重复性高和相对容易执行的优点，但灵敏度低，放射性强，在总体水平检测细胞的裂解，而不是在单细胞水平上，且只能提供半定量的数据。因此，有必要建立安全好、可定量、高通量的检测细胞毒的方法。

随着荧光测定仪器的普及和新的荧光标记物的发现，荧光测定法将有可能取代传统的⁵¹Cr释放法，以上阐述的缺陷促进了流式细胞计数法的发展。流式细胞术细胞毒性测定具有无放射性、检测单细胞水平的细胞毒性以及评估细胞毒性过程的所有阶段等优点。目前尚未有基于流式细胞术检测鸡脾脏CD8⁺T细胞特异性杀伤作用的相关报道。

发明内容

本发明的目的是针对放射性铬（⁵¹Cr）释放测定细胞毒性方法存在灵敏度低，放射性强等不足，建立一种更新、更可靠且可以单细胞水平检测细胞毒性的方法（即一种基于流式细胞术检测鸡脾脏CD8⁺T细胞特异性杀伤作用的方法）。

为了实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：一种基于流式细胞术检测鸡脾脏CD8⁺T细胞特异性杀伤作用的方法，其特征在于，可以单细胞水平检测鸡CD8⁺T细胞的特异性杀伤作用，包括如下步骤：

（1）细菌培养，所述的细菌为鸡白痢沙门菌S06004和S06004ΔspiC；

（2）鸡的免疫及采样；

（3）靶细胞—巨噬细胞的制备，首次将原代巨噬细胞作为靶细胞，更接近机体自然状态，提供更准确的结果；

（4）效应细胞—鸡脾脏CD8⁺T细胞的制备：包括鸡脾脏淋巴细胞悬液的制备步骤和磁珠分选鸡脾脏CD8⁺T细胞的步骤；

（5）CTL特异性杀伤巨噬细胞，通过流式检测凋亡，可以反应单细胞水平的特异性杀伤能力。