[发明专利]一种羊膜干细胞提取、培养的方法

说明书

本发明公开了一种羊膜干细胞提取、培养的方法，通过从胎盘上机械分离后清洗干净的健康羊膜用混合液1浸泡0.5～1h后，用三羟甲基氨基甲烷缓冲液清洗，用细胞刮轻刮羊膜表面去除上皮细胞，PBS冲洗3～5次，机械剪碎；再将羊膜碎片加入到混合液2中，消化至羊膜碎片基本消失；将羊膜消化悬液1/2X ml叠加在分离液上，1500～2000rpm离心30min，吸取第二层悬液；最后将第二层悬液放在培养基中进行重悬，将悬浮液接种于细胞培养皿后恒温培养。本发明羊膜干细胞提取效率更高、纯度更高。

技术领域

本发明属于干细胞提取培养技术领域，尤其涉及一种羊膜干细胞提取、培养的方法。

背景技术

随着组织工程学的发展，组织工程化骨可望成为骨移植或骨替代物的新选择。种子细胞是组织工程的三个基本要素之一，选择适当的种子细胞在骨组织工程中起着关键的作用。目前在骨组织工程领域运用较多的种子细胞主要有成骨细胞(OB)、骨髓间充质干细胞(BMSCs)和牙周膜干细胞(PDLSCs)等。但其获取时存在对患者损伤较大，取材量有限，细胞免疫原性较高等缺点，从而限制了其临床应用和发展。同时，关于种子细胞在纠正氧化应激所产生的骨损伤方面的作用和机制还未被深入研究。因此，在骨组织工程中选择易获取，产量高，低免疫原性和多分化潜能的种子细胞用于具有重要的科学意义。

羊膜位于胎盘的最内层，由单层的上皮细胞、基底膜和含有间充质细胞的海绵层组成，随孕羊分娩排出体外；羊膜间充质干细胞(AMSCs)可从分娩后废弃的胎盘中获得，是一种获取简单、产量高、低免疫原性、无伦理学限制的再生医学细胞来源。但是现阶段的羊膜干细胞提取技术面临效率较低，所提取干细胞纯度低等问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种羊膜干细胞提取、培养的方法，旨在解决现有羊膜干细胞提取技术面临效率较低，所提取干细胞纯度低等问题。

本发明是这样实现的，一种羊膜干细胞提取、培养的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将健康羊膜从胎盘上机械分离后进行洗涤以除去血液和残片；

(2)将洗涤后的羊膜用混合液1浸泡0.5～1h后，用三羟甲基氨基甲烷缓冲液清洗，用细胞刮轻刮羊膜表面去除上皮细胞，PBS冲洗3～5次，机械剪碎；其中，所述混合液1为含0.03～0.05％(w/v)十二烷基硫酸钠和0.1～0.5％(

w/v)乙二胺四乙酸的三羟甲基氨基甲烷缓冲液；

(3)将羊膜碎片加入到混合液2中，消化至羊膜碎片基本消失；其中，所述混合液2为含2～3g/LⅡ型胶原酶、0.05～0.1g/L DNaseⅠ和15％胎牛血清的α-MEM培养基的混和溶液；

(4)将羊膜消化悬液1/2X ml叠加在分离液上，1500～2000rpm离心30min，吸取第二层悬液；

(5)将所述第二层悬液放在培养基中进行重悬，将悬浮液接种于细胞培养皿后恒温培养。

优选地，在步骤(1)中，所述胎盘周数为38±1周，且胎盘获取时间为产妇剖宫产后4h以内获得；

所述洗涤为将羊膜放入含有双抗的PBS容器中反复洗涤。

优选地，在步骤(2)中，所述十二烷基硫酸钠浓度为0.03％(w/v)，所述乙二胺四乙酸浓度为0.1％(w/v)，所述浸泡的时间为0.5h；

所述羊膜机械剪碎至2mm*2mm大小。

优选地，在步骤(3)中，所述Ⅱ型胶原酶浓度为2g/L，所述DNaseⅠ浓度为0.05g/L；

所述消化的温度为37℃、CO₂的体积分数均为0.05。

优选地，在步骤(4)中，所述分离液为由1份10XPBS与9份聚乙烯吡咯烷酮贮存液混合而成的等渗聚乙烯吡咯烷酮分离液。