[发明专利]一种羊膜干细胞提取、培养的方法

权利要求书

1.一种羊膜干细胞提取、培养的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）将健康羊膜从胎盘上机械分离后进行洗涤以除去血液和残片；

（2）将洗涤后的羊膜用混合液1浸泡0.5~1h后，用三羟甲基氨基甲烷缓冲液清洗，用细胞刮轻刮羊膜表面去除上皮细胞，PBS冲洗3~5次，机械剪碎；其中，所述混合液1为含0.03~0.05%（w/v）十二烷基硫酸钠和0.1~0.5%（w/v）乙二胺四乙酸的三羟甲基氨基甲烷缓冲液；

（3）将羊膜碎片加入到混合液2中，消化至羊膜碎片基本消失；其中，所述混合液2为含2~3g/LⅡ型胶原酶、0.05~0.1g/L DNaseⅠ和15%胎牛血清的α-MEM培养基的混和溶液；

（4）将羊膜消化悬液叠加在分离液上，1500~2000rpm离心30min，吸取第二层悬液；

（5）将所述第二层悬液放在培养基中进行重悬，将悬浮液接种于细胞培养皿后恒温培养；

在步骤（4）中，所述分离液为由1份10×PBS与9份聚乙烯吡咯烷酮贮存液混合而成的等渗聚乙烯吡咯烷酮分离液。

2.如权利要求1所述的羊膜干细胞提取、培养的方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述胎盘周数为38±1周，且胎盘获取时间为产妇剖宫产后4h以内；

所述洗涤为将羊膜放入含有双抗的PBS容器中反复洗涤。

3.如权利要求1所述的羊膜干细胞提取、培养的方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述十二烷基硫酸钠浓度为0.03%（w/v），所述乙二胺四乙酸浓度为0.1%（w/v），所述浸泡的时间为0.5h；

所述羊膜机械剪碎至2mm*2mm大小。

4.如权利要求1所述的羊膜干细胞提取、培养的方法，其特征在于，在步骤（3）中，所述Ⅱ型胶原酶浓度为2g/L，所述DNaseⅠ浓度为0.05g/L；

所述消化的温度为37℃、CO₂的体积分数为0.05。

5.如权利要求1所述的羊膜干细胞提取、培养的方法，其特征在于，在步骤（4）中，所述分离液初始密度为1.1294g/mL；所述离心转速为1500rpm。

6.如权利要求1所述的羊膜干细胞提取、培养的方法，其特征在于，在步骤（5）中，所述培养基为由双抗混合液与含15％胎牛血清的α-MEM培养液充分混合均匀后制成；所述双抗混合液为青霉素80万 u+pbs 4mL、链霉素100万 u+pbs 5mL；

所述培养的温度为37℃、CO₂的体积分数为0.05。