[发明专利]一种产猪表皮生长因子的重组枯草芽孢杆菌工程菌及应用

说明书

本发明属于兽用微生物添加剂制备技术领域，具体涉及一种产猪表皮生长因子的重组枯草芽孢杆菌工程菌及应用。以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB800为出发菌株，通过同源重组敲除淀粉酶基因amy‑E并引入猪来源的表皮生长因子EGF，构建稳定且高分泌型工程菌，实现了猪表皮生长因子的高效分泌表达。动物实验表明该菌株对受损肠道具有较好的修复作用，同时能够降低IFN‑γ、IL‑1β、TNF‑α等炎症因子的分泌，促进肠绒毛生长，提高动物生长性能。为实现猪来源的表皮生长因子的工业化制备生产奠定了基础，为饲添抗生素的替代及畜牧业的健康、可持续发展提供技术支撑。

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种产猪表皮生长因子(pEGF)的枯草芽孢杆菌工程菌及其制备方法与应用。

背景技术

表皮生长因子是1962年Cohen用梭甲基纤维素柱从小鼠颇下腺分离纯化神经生长因子(NGF)时发现的一种活性物质，当时根据它促进新生小鼠门齿的萌出及眼睑睁开的功能，将它命名为“齿睑因子(Tooth-Lid Factor)”，随后发现这种多肽能够促进表皮生长，于是改称为“表皮生长因子(m EGF)”。表皮生长因子主要由唾液腺、胆汁、Paneth细胞、十二指肠的Brunner’s腺和胰腺等分泌至胃肠道，发育中的幼龄动物EGF主要来源于母乳和唾液。EGF对酸和热比较稳定，能抵抗胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶的消化作用，这对其维持结构的稳定和发挥生物学作用具有重要的意义。

猪表皮生长因子(Epidermal growth factor，简称pEGF)是一种含有53个氨基酸的单链多肽，分子量为6216道尔顿，其功能和结构与人、小鼠、大鼠等动物的EGF类似。EGF是一种强有力的细胞分裂促进因子，它不仅在上皮细胞，而且在间皮和内皮细胞发挥其生物效应。EGF在机体发育中起作用，影响其生长和分化。EGF对生物体的作用表现得极为广泛，主要体现在:(1)在体内刺激皮肤组织、角膜、肺、气管上皮组织的生长繁殖；(2)诱导新生眼睑的打开；(3)加速胃溃疡的治疗和抑制胃酸的分泌；(4)增强表皮细胞的蛋白质、RNA的合成和细胞代谢；(5)加速角膜、肠道等创伤的修复；(6)对某些癌症的治疗有一定的疗效等。因此，猪表皮生长因子被广泛作为药物和饲料营养添加剂来提高动物肠道健康，促进营养物质消化吸收。此外表皮生长因子在化妆品和制药领域也具有诸多应用。

猪的血液、乳汁及胃液等含有的内源性pEGF很少，并且处于与受体结合的生理状态，从生物来源中提取pEGF比较困难且成本较高，难以实现。目前生产hEGF主要有2种途径：一种是化学合成法，虽然产物纯度高但是产率不高，而且蛋白质不能像生物合成一样折叠，无法工业化生产。另一种方法是采用基因工程技术构建重组质粒表达pEGF。基因重组pEGF的基本策略首先构建出含pEGF目的基因的整合表达载体，再将该表达载体转化至枯草芽孢杆菌，使pEGF整合到枯草芽孢杆菌基因组中，最后对该重组枯草芽孢杆菌进行发酵，获得具有生物学活性的重组pEGF。

在现代集约化养殖生产体系下，为了获得最大的经济效益，仔猪的中、早期断奶被广泛采用。然而仔猪早期断奶不可避免地引起了断奶应激的发生，随断奶日龄的提前，断奶应激更加强烈，应激损伤更为严重。断奶应激引起仔猪肠道微生态环境失衡、功能紊乱、肠道发育受阻，而影响营养物质的消化、吸收，导致其生产性能下降，对病原微生物易感。生产上为了降低早期断奶应激对仔猪生产性能的影响，减少养殖业经济损失，通常采用在饲料中长期添加抗生素，由于抗生素的滥用，致使微生物产生耐药性，造成动物内源性感染和二重感染，易在畜产品和环境中造成残留等问题引起了人们的广泛关注。目前国内外推行健康养殖，生产绿色食品，允许作饲料添加剂的抗生素已寥寥无几。因此，开发或寻找替代抗生素的产品已经成为当今医药业和畜牧业开发的热点。