[发明专利]一种利用Trans Well小室分离精子释放蛋白的方法

说明书

本发明公开了一种利用Trans Well小室分离精子释放蛋白的方法，该方法充分利用Trans well小室独特的滤膜装置，运用材料中特有的聚碳酸酯膜组成的微孔滤膜，将孔板内的培养空间分为上、下室两部分，从而将精子细胞与释放蛋白分离开，消除了因上、下室培养液成分不同、作用条件不同等造成的实验干扰，探究出分离附睾头部精子释放蛋白的技术要点。本发明分离的精子释放蛋白的成功率高、操作简便、蛋白降解率低、稳定性高，费用低，可替代传统的精子蛋白混合取样不能明确来源的缺陷，避免了精子质膜成分与结构蛋白对分泌蛋白精准分离的误差影响。

技术领域

本发明属于生化技术领域，具体是一种利用Trans Well小室分离精子释放蛋白的方法。

背景技术

附睾是哺乳动物精子成熟、获得受精能力、储存和保护精子的重要器官，其作为精子到达输精管的通道，附睾液中的蛋白质由附睾上皮分泌并与精子相互作用或被吸收到精子表面，为精子的成熟和储存提供特殊的微环境。附睾液微环境的组成随着精子通过的不同区段而发生复杂和连续的变化。附睾头部、体部和尾部的基因表达相差较大，头部已被证明是蛋白合成和分泌非常活跃的区域，而体部和尾部较少。目前研究还发现大部分不呈区域化表达蛋白属于组成性蛋白，而分泌到附睾管腔液的蛋白则呈现高度的区域化，而且在附睾管腔中极少有蛋白存在连续分泌现象。目前的研究主要集中在附睾液中蛋白的种类和作用，而对于处在附睾微环境中精子释放蛋白的探究较少。

蛋白质组学是一门新兴学科，它以大规模、高通量系统的方式研究某种类型的细胞、组织或体液含有所有蛋白质的功能。Trans well小室(Trans well chamber、Transwell insert)由美国康宁(corning)开发生产，该材料中间有一层聚碳酸酯膜(polycarbonate membrane)组成的微孔滤膜将孔板内的培养空间分为上、下室两部分，根据不同细胞其体积不同，孔径为0.1-12μm不等，主要应用于共培养、趋化、迁移、侵袭等细胞实验。本研究将充分利用Trans well小室独特的滤膜装置，将精子细胞与释放蛋白分离为两部分，同时，消除了因上、下室培养液成分不同、作用条件不同等造成的实验干扰，探究出分离猪附睾头部精子释放蛋白的新方法。

以上背景技术内容的公开仅用于辅助理解本发明的发明构思及技术方案，其并不必然属于本专利申请的现有技术，在没有明确的证据表明上述内容在本专利申请的申请日已经公开的情况下，上述背景技术不应当用于评价本申请的新颖性和创造性。

发明内容

本发明目的在于提供一种利用Trans Well小室分离精子释放蛋白的方法。本方法能够充分利用Trans well小室独特的滤膜装置，将精子细胞与释放蛋白分离开，消除了因上、下室培养液成分不同、作用条件不同等造成的实验干扰。分离精子释放蛋白的成功率高、操作简便、蛋白降解率低、稳定性高、费用低等优点。

为了实现以上目的，本发明采用的技术方案如下：

一种利用Trans Well小室分离精子释放蛋白的方法，包括如下步骤：

(1)取性成熟的动物摘除附睾，剔除脂肪组织和结缔组织，用PBS冲洗血迹，浸润在生理盐水中，在附睾头部、附睾尾切出一个小孔，以便空气可以流通，保持管腔内大气压恒定，用注射器针头缓慢刺入附睾头部曲细精管内，轻轻挤压曲细精管并抽取精液，用EP管收集；

(2)收集到的精子在室温下离心后，弃去上清，保留沉淀，悬浮于1mLNC-BWW培养液中；将NC-BWW培养液作为稀释液将精子浓度调整为2-5×10⁵；调整好浓度的精子孵育30-60min；

(3)将孵育后的精子进行分离，取稀释后的精子细胞溶液2mL在单个Trans well小室内进行培养，所述Trans well小室是由聚碳酸酯膜隔开的上室和下室孔组成；将Transwell小室孵育30-60min，以便精子在生理状态下正常分泌蛋白，将上、下室的组分用2mL EP管分别收集，上室收集的组分为精子，下室收集的组分为精子释放蛋白及培养液，并将样品置于-80℃保存。