[发明专利]利用5-氮杂胞嘧啶核苷提高大豆抗性丛生芽诱导效率的方法

说明书

本发明涉及利用5‑氮杂胞嘧啶核苷提高大豆抗性丛生芽诱导效率的方法，属于转基因技术领域。主要技术方案如下：灭菌、萌发、配制农杆菌菌液、农杆菌侵染大豆子叶节、抗性丛生芽诱导。本发明首次在农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化体系中，使用甲基化抑制剂5‑氮杂胞嘧啶核苷对诱导抗性丛生芽的大豆子叶外植体进行去甲基化处理，提高了大豆子叶外植体的抗性丛生芽的诱导效率，这可能会导致T0代转化效率的提高。

技术领域

本发明涉及转基因技术领域，具体涉及利用5-氮杂胞嘧啶核苷提高大豆抗性丛生芽诱导效率的方法。

背景技术

大豆是我国主要的食用油、食用蛋白质和饲料作物，其产量和品质的改良对经济和农业产业具有重要意义。运用常规育种方法进行的大豆品质改良具有培育周期长，操作繁琐，种间配合力差等缺点，而转基因技术提供了一种打破物种壁垒的有效方法，极大的促进了作物的遗传改良进程，从而加速了高质量/高产作物品种的选择过程。近些年来转基因技术得到了长足的发展，但是与其他物种相比，大豆转化效率低下是制约大豆基因功能研究的一个技术屏障，限制了其商业化发展。因此，建立高效的大豆转基因体系将对大豆功能基因组学的研究和转基因技术的发展具有重要意义。

农杆菌介导的遗传转化是最有效和最广泛应用的大豆遗传转化方法。然而，以往的研究表明农杆菌介导的大豆转化效率与大豆基因型密切相关，这一特点显著限制了转基因技术在一些具有良好农艺性状的品种中的应用。目前主要通过筛选高转化效率的大豆品种来解决大豆转基因效率低下问题，但是缺少有效的方法来提高低转化效率品种的转化效率。

发明内容

为弥补现有技术的不足，本发明提供一种利用5-氮杂胞嘧啶核苷提高大豆抗性丛生芽诱导效率的方法。通过在农杆菌介导的大豆遗传转化体系中的抗性丛生芽诱导培养基中添加DNA甲基化抑制剂5-氮杂胞嘧啶核苷(5-Azacytidine)来提高低转化效率大豆品种的抗性丛生芽的诱导效率，以期提高低转化效率大豆品种的转基因效率。

本发明的技术方案如下：利用5-氮杂胞嘧啶核苷提高大豆抗性丛生芽诱导效率的方法，包括以下步骤：

(1)大豆种子灭菌

(2)大豆种子萌发

(3)配制农杆菌菌液

(4)农杆菌侵染大豆子叶节

(5)抗性丛生芽诱导

将大豆的子叶近轴面向上，斜插入到抗性丛生芽诱导培养基中，26℃下光周期培养，每7天更换新的培养基，培养2周，即可得到抗性丛生芽；在诱导培养过程中，添加8-50μM5-氮杂胞嘧啶核苷到抗性丛生芽诱导培养基。

进一步的，步骤(5)所述斜插的角度为45°。

进一步的，在诱导培养第二周添加8-50μM 5-氮杂胞嘧啶核苷到抗性丛生芽诱导培养基。

进一步的，在诱导培养第一周、第二周均添加8-50μM 5-氮杂胞嘧啶核苷到抗性丛生芽诱导培养基。

进一步的，在诱导培养第一周添加8-50μM 5-氮杂胞嘧啶核苷到抗性丛生芽诱导培养基。

进一步的，在诱导培养第二周添加10μM 5-氮杂胞嘧啶核苷到抗性丛生芽诱导培养基。

进一步的，所述抗性丛生芽诱导培养基的配方如下：3.21g/L B5基础培养基、30g/L蔗糖、18mM 2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物、7.5uM 6-苄基氨基嘌呤、5mg/L草丁膦、3g/L凝胶，调节pH为5.8。