[发明专利]一种重组荞麦防御素蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及生物技术和医药保健品领域，提供了一种重组荞麦防御素蛋白及其制备方法和应用，所示重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，其氨基酸分子量为6.3kDa，等电点8.5；该重组荞麦防御素蛋白具有抗真菌作用，在医疗保健，食品开发和化妆品研发等方面具有实用价值。

技术领域

本发明涉及生物技术和医药保健品领域，具体涉及一种重组荞麦防御素(recombinant buckwheat defensin)蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

真菌型疾病对植物，动物和人类产生巨大影响。它们会破坏农作物，威胁野生动物的灭绝并且可以杀死更容易受到真菌感染的免疫功能低下的人群。所有生物在进化过程中都有相应策略来逃避病原体的感染。植物具有许多独特的防御机制，包括病原体入侵的物理屏障以及广泛的次级代谢产物和抗菌肽(antimicrobial peptides，简称AMP)。植物AMP包括硫素，脂质转移蛋白，橡胶素，打结素，富含甘氨酸的肽，MBP-1(来自玉米的AMP)的同源物，蜕皮素，环肽，蛋白酶抑制剂(PI)和防御素。植物中的AMP通常在种子和生殖组织中表达，并且还受到干旱，盐，冷，病原体入侵或伤害诱导的应激的上调，可抑制杀死多种病原真菌，因此可用来研制新型的杀菌剂或新型的抗生素类药物。

植物防御素是植物先天免疫系统的主要成分。通常，它们对哺乳动物或植物细胞无毒。然而，它们对植物和人类的真菌病原体具有极高的活性。植物防御素是在种子中常见的小的阳离子蛋白质，但也位于植物的其他部分，包括叶，根，树皮，豆荚，块茎，果实和花器官。它们集中在表皮细胞和气孔细胞中，产生于可能是与病原体接触的初始点。植物防御素由45-54个氨基酸残基组成，并通过四个二硫键保持在一起。这些二硫键使得分子对蛋白酶和极端的pH和温度高度稳定。八个高度保守的半胱氨酸的间距和连接性定义了植物防御素家族。

基于以上研究背景，由于真菌防御素具有高度稳定性，良好的水溶性、安全无毒、且抑菌谱广、具备保健作用的特点，但在生物体中含量低，难以天然提取，而化学合成方法成本高，无法满足工业化生产的需求，因此，借助于基因工程与蛋白质工程手段是大规模生产防御素的一条经济有效的途径。

发明内容

基于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种重组荞麦防御素蛋白及其制备方法和应用，通过构建荞麦防御素蛋白的重组表达载体，利用重组表达技术获得重组荞麦防御素蛋白，该蛋白对真菌有抑菌活性，生产及纯化方法简单，在医疗保健、食品开发和化妆品研发等方面具有实用价值。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一方面，本发明提供的一种重组荞麦防御素蛋白，该蛋白含有75个氨基酸，预测的信号肽序列为前端18个氨基酸残基，理论分子量为6.3kDa，等电点为8.5。所述重组荞麦防御素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；其中，SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列如下：

MEKKVLGLLL FIIVFASGIG THMVEVEGKT CTKPSKYYHG WCVAGCGGAC KKEN WPQGDCEGYGFKSHCV CKRPC。

去除前端18个氨基酸后的重组荞麦防御素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；其中，SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列如下：

IGTHMVEVEG KTCTKPSKYY HGWCVAGCGG ACKKENWPQG DCEGYGFKSH CVCK RPC。

另一方面，本发明还提供了一种DNA片段，其包含编码如上所述的重组荞麦防御素蛋白的核苷酸序列。

根据本发明，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述SEQ ID NO.3表示的核苷酸序列如下：