[发明专利]一种适用于发酵过程中地衣芽孢杆菌RNA的提取方法

说明书

本发明公开了一种适用于发酵过程中地衣芽孢杆菌RNA的提取方法，该方法在确定了不同发酵时期菌体收集比例的情况下，结合了大肠杆菌等常见微生物的普通RNA试剂盒(上海生工RNA提取试剂盒、BioFlux RNA提取试剂盒、TaKaRa RNA提取试剂盒、杭州宝赛生物RNA提取试剂盒等)提取法和传统手提RNA法，能够显著提高地衣芽孢杆菌RNA提取质量，而且RNA提取所需菌液液少(50‑300μL)；提取的RNA具有纯度高、浓度适中、稳定性高等优点，能够充分满足RT‑PCR、RT‑qPCR等下游应用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种发酵过程中提取地衣芽孢杆菌RNA的方法。

背景技术

核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA)，是一种存在于生物细胞、以及部分病毒、类病毒中的遗传信息的载体。它是以DNA的一条链为模板，根据碱基互补配对原则，转录而形成的一条单链，其主要功能是实现遗传信息在蛋白质上的表达，是遗传信息向表型转化过程中的桥梁。通过对不同状态下微生物的RNA进行定量分析，可以充分了解生物体的表型调控，获知基因的表达情况，而在这类研究中质量合格的RNA是确保研究实验成功的前提。

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)属革兰氏阳性菌，是重要的工业微生物菌株，其在转录方面的研究常常受限于RNA的质量。目前在提取地衣芽孢杆菌RNA时，使用传统方法或者普通试剂盒方法均无法获得良好效果。通常会遇到以下情境：一是传统手提方法需要收集的菌体量比较大(大于10mL)，而且耗时长，这往往会对发酵过程中菌体的生长和代谢造成极大的影响，导致后续的RT-PCR、RT-qPCR、转录组分析等实验的准确性低、重现性差。二是不同生长状态的地衣芽孢杆菌胞内蛋白含量含量不同，提取的RNA质量也差别很大，因为收集过多或过少的菌体都会降低RNA的质量。三是在地衣芽孢杆菌发酵过程中，该菌胞外分泌蛋白能力很强，蛋白类物质常常附着在菌体表面，传统手提方法会导致提取过程蛋白残留过多，而试剂盒中的去蛋白溶液往往会起到不错的效果。四是地衣芽孢杆菌细胞壁较厚，试剂盒提供的化学试剂裂解困难，目前流行的Tissue Cell-Destroyer DS1000在破壁时需要破碎一段时间停止一段时间，耗时较长，容易使RNA降解，而传统的研钵研磨法研磨30s即可完成破壁。五是地衣芽孢杆菌在液态发酵过程中会形成一层“菌膜”或者絮状沉淀，导致收集的菌体均一性较差。总的来说，目前并没有针对地衣芽孢杆菌这一特别的革兰氏阳性菌说明提取方法。

在发酵过程中菌体达稳定期，菌体量随着时间增加而增加，所以根据发酵过程中菌液的OD600可以确定菌体收集比例。发酵前期菌体代谢速率较低，产蛋白量也较低，因此需要收集的细胞数量也较多；发酵后期菌体代谢活跃，蛋白分泌量高，因此需要适量降低收集的细胞数目，避免RNA提取过程中杂蛋白的影响。

基于以上背景，确定菌体收集比例的基础上，结合传统手提方法和试剂盒提取法可以克服上述困扰，获得质量合格的RNA，而且不会影响发酵过程中地衣芽孢杆菌的生长和代谢，确保后续实验的成功。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明申请人提供了一种适用于发酵过程中地衣芽孢杆菌RNA的提取方法。本发明适用于多种实验室常用细菌试剂盒，能够显著提高地衣芽孢杆菌RNA提取质量，完全满足RT-PCR、RT-qPCR等下游应用。

本发明的技术方案如下：

一种适用于发酵过程中地衣芽孢杆菌RNA的提取方法，所述提取方法包括如下步骤：

(1)根据菌体量，收集地衣芽孢杆菌发酵过程中的发酵液；

(2)对步骤(1)获得的发酵液进行洗涤、破碎、酶解处理；

(3)采用试剂盒对经过步骤(2)处理后的样品进行裂解、除杂、洗涤、洗脱。

所述方法的具体步骤为：