[发明专利]在枯草芽孢杆菌中表达真实的和具有生物活性的碱性成纤维细胞生长因子的方法和工具

说明书

本发明涉及一种产生146个氨基酸的真实的和具有生物活性人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的方法，所述bFGF的C‑或N‑末端没有任何修饰。该方法包括以下步骤：提供枯草芽孢杆菌宿主，将DNA构建体引入枯草芽孢杆菌宿主以产生转化的枯草芽孢杆菌宿主，该DNA构建体包括插入物，所述插入物从5'端至3'端包括纤维素结合域(CellBD)、内含肽序列和编码bFGF多肽的DNA，并将转化的枯草芽孢杆菌宿主进行摇瓶培养过程或补料分批发酵过程。

相关申请

本申请要求2018年5月7日提交的在先的香港申请号为No.18105835.8的优先权，其内容以其整体并入本文。

序列表

本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且其全部内容通过引用并入本文。所述ASCII拷贝在2019年3月15日创建，命名为G02-008A 190315 Sequencelisting.txt，大小为5KB。

发明领域

本发明涉及在枯草芽孢杆菌中表达真实的和具有生物活性的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，bFGF具有146个氨基酸残基。

背景技术

碱性成纤维细胞生长因子是功能上通用但目前非常昂贵的多肽。尽管过去已经提出了多肽的生产方案，但许多这样的提议并不涉及产生具有天然特征的真实的和具有生物活性的成纤维细胞生长因子。换言之，许多此类提议仅能够产生与天然多肽不相似或不具有相似功效的类似物或同种型。在某些情况下，还存在由多肽或类似物的产生引起的安全性问题。例如，一些提议使用了会产生不希望的副产物的生物系统，例如，有毒物质，依赖于不适合人类应用的人碱性成纤维细胞生长因子的分离。

另一方面，重组蛋白的成本效益(cost-effective)生产是产品在市场上广泛可用的先决条件。碱性成纤维细胞生长因子，尽管显示在包括血管生成，伤口愈合和软骨形成在内的各种生理过程中发挥重要作用的通用蛋白质，但尚未如预期的那样普遍应用。例如，真正的人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是包含146个氨基酸残基的16.5kDa蛋白质(SEQ IDNO.1-NH₂PALPEDGGSG^|10AFPPGHFKDP^|20KRLYCKNGGF^|30FLRIHPDGRV^|40DGVREKSDPH^|50IKLQLQAEER^|60GVVSIKGVCA^|70NRYLAMKED^|80GRLLASKCVT^|90DECFFFERLE^|100 SNNYNTYRSR^|110KYTSWYVALK^|120RTGQYKLGSK^|130TGPGQKAILFL^|140PMSAKS-COOH)。然而，基本上只有各种分子大小的bFGF的结构类似物可用于商业应用。原因可能是由于使用常规克隆方法，这些方法无法建立具有成本效益的处理方案，从而导致bFGF。因此，bFGF通常不用于皮肤护理或治疗应用。然而，令人遗憾的是，尽管不真实，但bFGF类似物以极高的价格出售，在提交本申请时，每毫克约1300美元至2000美元不等。因此，市场上只有具有成本效益的bFGF供应可能有助于降低其不合理的高价格。

本发明试图解决上述问题，或者至少向公众提供替代方案。.

发明内容