[发明专利]一种用于分离肿瘤细胞的分离管的制备方法

说明书

本发明提供一种用于分离肿瘤细胞的分离管的制备方法，属于细胞分离技术领域，先向分离管内加入分离胶，离心使其沉到管底，再加入分离介质，然后将体腔积液或抗凝全血缓慢加入到分离介质的上层，室温离心后，先吸弃分离管最上面的液体以除去细胞碎片，然后将分离胶层上方的剩余液体倾倒入收集管中，再进行室温离心后，用PBS重悬细胞后即可获得肿瘤细胞，所述分离胶的密度为1.06‑1.08g/mL，所述分离介质的密度为1.05‑1.06g/mL。本发明可用于分离循环肿瘤细胞和体腔积液肿瘤细胞，制备方法简便高效，且分离得到的肿瘤细胞的纯度较高。

技术领域

本发明属于细胞分离技术领域，具体涉及一种用于分离肿瘤细胞的分离管的制备方法。

背景技术

体腔积液是指人体脏器周围腔隙的积液，主要包括胸腔、腹腔、盆腔以及蛛网膜下腔等的积液。体腔积液与许多类型的恶性肿瘤有关，如肝癌、肺癌、乳腺癌、Koposi肉瘤和淋巴瘤等。分离和鉴定体腔积液中肿瘤细胞及其基因突变类型对于疾病诊断、病情评估以及治疗策略的制定都具有重要的临床意义。肿瘤患者体腔积液中细胞类型较为复杂，主要包括红细胞、白细胞以及间皮细胞等，肿瘤细胞数量相对较少，对于转移早期或已接受治疗的患者来说，肿瘤细胞数量可能会更低。在传统临床病理检测中，用少量体腔积液离心后进行细胞形态学分析可能会导致假阴性的结果。文献报道，在多达40％的病例中，传统的细胞学检查无法检测到肿瘤细胞，故从体腔积液中富集纯化肿瘤细胞可以明显改善基于细胞学诊断的灵敏度。

循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)是指脱落于肿瘤原发灶或转移灶，经由上皮间质转化后侵入血液循环的肿瘤细胞。由于CTC能逃避机体的免疫监视，可随血液循环到达并驻留于其它组织器官，发生间质上皮转化后增殖形成新的肿瘤病灶。CTC可用于肿瘤早期诊断、预后判断，制定/调整治疗方案以及疗效和复发的实时监测等。

在临床医学的检验中，Percoll是一种通过密度离心方法分离细胞的介质，因其渗透压低，对细胞无毒等特点，广泛用于含不同细胞类型生物样品中目的细胞的分离。但直接用Percoll通过密度离心方法分离循环肿瘤细胞或体腔积液肿瘤细胞，在收获肿瘤细胞的同时不可避免要受到其它细胞的污染，不能获得较高纯度的肿瘤细胞。因此急需一种能够解决现有问题，且应用于分离体腔积液肿瘤细胞和循环肿瘤细胞的分离管的制备方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种用于分离肿瘤细胞的分离管的制备方法，该分离管可用于分离循环肿瘤细胞和体腔积液肿瘤细胞，分离得到的肿瘤细胞的纯度较高。

本发明提供了如下的技术方案：

一种用于分离肿瘤细胞的分离管的制备方法，包括如下步骤：

S1：先将密度为1.06-1.08g/mL的分离胶加入到分离管中，室温条件下，设定离心力为1000-1200g，离心3-10min，使分离胶沉于分离管管底；

S2：再将密度为1.05-1.06g/mL的分离介质加入到分离胶上层；

S3：将肿瘤患者穿刺得到的体腔积液或抗凝全血缓慢加入到分离介质的上层，室温条件下，设定离心力为1000-1200g，离心8-12min，分离管中部形成不通透的分离胶层，将分离胶层上方的肿瘤细胞和分离胶层下方的非目的细胞有效分开；

S4：吸弃分离管内最上面的液体以除去细胞碎片，吸弃液位于分离胶层的上方；

S5：然后将分离胶层上方剩余液体倾倒至收集管中，室温条件下，设定离心力为800-1000g，离心3-10min，再用PBS重悬细胞后即可获得肿瘤细胞。

优选的，所述分离胶为聚脂、羟基硅油、聚烯烃、有机聚硅氧烷、丙烯中任意一种或任意若干种的混合液，所述分离胶具有触变性特点。

优选的，所述分离介质为Percoll、聚蔗糖、泛影葡胺中任意一种或任意若干种的混合液。