[发明专利]一种枯草芽孢杆菌中唾液酸诱导表达元件及构建方法

说明书

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌中唾液酸诱导表达元件及构建方法，属于遗传工程领域。本发明以pHT质粒为载体，在枯草芽孢杆菌中，P_ydjO启动子表达转录调控蛋白NanR，进一步在强启动子P_veg中整合NanR识别结合序列，并关联绿色荧光蛋白GFP，在发酵培养基中添加唾液酸进行发酵验证，成功构建枯草芽孢杆菌中唾液酸诱导表达元件，使其诱导表达强度达到4000a.u.，在不添加唾液酸的情况下，泄漏量为10％，为进一步优化枯草芽孢杆菌中唾液酸诱导表达元件奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌中唾液酸诱导表达元件及构建方法，属于遗传工程领域。

背景技术

在枯草芽孢杆菌中，可诱导激活表达的启动子元件，广泛应用于代谢工程领域。目前，枯草芽孢杆菌中常用的诱导启动子，有木糖诱导启动子P_xyl和IPTG诱导启动子P_grac。然而，木糖诱导启动子P_xyl的诱导剂木糖可被枯草芽孢杆菌代谢消耗，IPTG诱导启动子P_grac的诱导剂IPTG对细胞存在一定毒性的问题。以上缺陷，严重限制了其在枯草芽孢杆菌代谢工程领域的应用。唾液酸作为一种简单碳源，且对细胞无毒，且不会被枯草芽孢杆菌代谢消耗，是一种合适的诱导物。通过基因工程改造启动子，可以获得基于唾液酸诱导的更合适于枯草芽孢杆菌的响应元件。然而，如何改造启动子，以响应唾液酸实现较高的诱导表达是一个值得深入研究的问题。另外，枯草芽孢杆菌缺失唾液酸天然转运途径，不能转运胞外唾液酸至胞内，这限制了唾液酸诱导表达元件在枯草芽孢杆菌代谢工程领域的应用。

发明内容

为解决上述技术问题，实现响应于唾液酸的诱导表达启动子元件，本发明以组成型启动子P_ydjO表达转录调控蛋白NanR，进一步通过在组成型启动子P_veg中，整合转录调控蛋白NanR结合序列TTNANNTGGTATAACAGGTATANAGNTANNNNNTNN，实现以枯草芽孢杆菌添加唾液酸后，达到较高强度的诱导表达水平和较低的泄漏表达水平。

本发明的第一个目的是提供一种诱导表达启动子元件；该元件响应的诱导底物为唾液酸，所述元件含有NanR蛋白、P_ydjO启动子、P_veg和NanR结合序列的质粒；所述P_ydjO启动子为组成型启动子，表达转录调控蛋白NanR；组成型启动子P_veg与调控蛋白NanR结合序列TTNANNTGGTATA ACAGGTATANAGNTANNNNNTNN整合；启动子P_ydjO和启动子P_veg的转录方向相反。

在本发明的一种实施方式中，组成型P_ydjO启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，转录调控蛋白P_veg启动子的核苷酸序列如SEQ NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，转录调控蛋白NanR氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，唾液酸转运蛋白NanT氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，整合NanR结合位点序列的P_veg启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明的第二个目的是提供含有所述唾液酸诱导表达元件的基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以枯草芽孢杆菌为宿主。

本发明的第三个目是提供一种唾液酸诱导表达元件在枯草芽孢杆菌代谢工程领域的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用为促进目的蛋白的表达。