[发明专利]一种活体心肌片光学成像的方法

说明书

本发明公开了一种活体心肌片光学成像的方法，属于光学成像技术领域。所述活体心肌片光学成像的方法，包括如下步骤：步骤1：离体心脏灌流；步骤2：负载钙敏感性荧光染料和电压敏感性荧光染料；步骤3：活体短轴心肌片制备；步骤4：光学标测。本发明结合光遗传技术、光学标测和活体心肌片技术，将光遗传转基因小鼠的心脏进行活体短轴切片，利用超高分率相机进行光学标测的方法，用于检测分析蓝光刺激后心肌片膜电位和钙瞬变的传导特征，为心脏的生理学和病理学开辟了新的研究方法。

技术领域

本发明涉及一种活体心肌片光学成像的方法，属于光学成像技术领域。

背景技术

心脏基础研究主要采用从分离的心肌细胞到复杂的多细胞组织的传统生物模型，后者包括离体心脏和完整的组织块(如分离的心肌条和灌注的心肌块)。然而，分离的心肌细胞在酶分离过程中破坏了心肌细胞与细胞外基质之间的连接，严重影响了心肌细胞的电生理功能；多细胞组织则出现体外灌注和组织缺血相关的问题。

光遗传学是利用光激活光敏离子通道和视蛋白(opsins)，使细胞去极化或超极化，可控制可兴奋细胞的“开”和“关”。这项新兴技术以神经科学为基础，现在越来越多地被用于心电生理研究。蓝光刺激可引起心肌细胞电兴奋、恢复心肌细胞电传导、实现心脏再同步化，甚至可以模拟心律失常；离体及在体实验证实利用光遗传学技术实现光起搏心脏；抑制和操纵心肌细胞单层中的转子，阐明心肌细胞和非心肌细胞亚群在心脏中的作用。

光学标测具有很高的时间分辨率(几十微秒)和空间分辨率(数微米)，多位点、动态测定和跟踪心脏的电传导、动作电位和钙瞬变，具有非侵入性，这是传统电极技术无法比拟的。但是，目前尚未出现将光遗传学、光学标测与活体心肌片三者相结合，实现在活体心肌片上进行非损伤式高通量采集心电信号和钙瞬变信号，研究目的细胞群的功能。

鉴于此，有必要研究活体心肌片光学成像的方法，以解决现有技术的不足。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种活体心肌片光学成像的方法。本发明将光遗传转基因小鼠的心脏进行活体短轴切片，利用超高分率相机进行光学标测的方法，用于检测分析心肌片膜电位和钙信号的传导特征，为心脏生理学和病理学开辟新的研究方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种活体心肌片光学成像的方法，包括如下步骤：

步骤1：离体心脏灌流

步骤1.1：取光遗传转基因成年小鼠，进行麻醉；

步骤1.2：开胸，快速取出心脏，置于37±1℃的Krebs液中，去除结缔组织后行主动脉插管，固定在Langendroff系统上，采用Krebs溶液灌流，得到灌流后的离体心脏；

步骤2：负载钙敏感性荧光染料和电压敏感性荧光染料

步骤2.1：将钙敏感性荧光染料Rhod-2AM与表面活性剂Pluronic F127按1:1混合后，稀释于1ml Krebs溶液中，再缓慢注射到步骤1.2得到的灌流后的离体心脏中，然后在Rhod-2AM染料中循环20min，得到负载钙敏感性荧光染料的离体心脏；

步骤2.2：继续将30μl电压敏感性荧光染料RH237稀释在1ml Krebs溶液中，再缓慢注射到步骤2.1得到的负载钙敏感性荧光染料的离体心脏中，得到负载钙敏感性荧光染料和电压敏感性荧光染料的离体心脏；

步骤2.3：用10μM Blebbistatin的Krebs溶液循环灌流步骤2.2得到的负载钙敏感性荧光染料和电压敏感性荧光染料的离体心脏，直至心脏停跳，得到停跳后的心脏；

步骤3：活体短轴心肌片制备