[发明专利]一种活体心肌片光学成像的方法

权利要求书

1.一种活体心肌片光学成像的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：离体心脏灌流

步骤1.1：取光遗传转基因成年小鼠，进行麻醉；

步骤1.2：开胸，快速取出心脏，置于37±1℃的Krebs液中，去除结缔组织后行主动脉插管，固定在Langendroff灌流系统上，采用Krebs溶液灌流，得到灌流后的离体心脏；

步骤2：负载钙敏感性荧光染料和电压敏感性荧光染料

步骤2.1：将钙敏感性荧光染料Rhod-2 AM与表面活性剂Pluronic F127按1:1混合后，稀释于1ml Krebs溶液中，再缓慢注射到步骤1.2得到的灌流后的离体心脏中，然后在Rhod-2 AM染料中循环20min，得到负载钙敏感性荧光染料的离体心脏；

步骤2.2：继续将30μl电压敏感性荧光染料RH237稀释在1ml Krebs溶液中，再缓慢注射到步骤2.1得到的负载钙敏感性荧光染料的离体心脏中，得到负载钙敏感性荧光染料和电压敏感性荧光染料的离体心脏；

步骤2.3：用10μM Blebbistatin的Krebs溶液循环灌流步骤2.2得到的负载钙敏感性荧光染料和电压敏感性荧光染料的离体心脏，直至心脏停跳，得到停跳后的心脏；

步骤3：活体短轴心肌片制备

步骤3.1：将2,3-丁二酮单肟溶液置于冰箱中冻成冰水混合物，将步骤2.3得到的停跳后的心脏从Langendorff系统中取出，置于冰水混合的2,3-丁二酮单肟溶液中，得到冰2,3-丁二酮单肟溶液处理过的心脏；

步骤3.2：采用低温琼脂包埋步骤3.1得到的冰2,3-丁二酮单肟溶液处理过的心脏，得到包埋后的心脏；

步骤3.3：将步骤3.2得到的包埋好的心脏粘在振动性切片机的样品托盘上，然后将托盘置于样品浴槽中，在样品浴槽中加入冰2,3-丁二酮单肟溶液，直至完全浸没心脏，进行切片，得到切片好的心肌片；

步骤3.4：将步骤3.3得到的切片好的心肌片，置于冰2,3-丁二酮单肟溶液中，孵育8min-12min；

步骤3.5：依次转移至三份分别含10μM的Blebbistatin的Krebs溶液中，均室温孵育8min-12min，得到光学标测用心肌片；

步骤4：光学标测

步骤4.1：将步骤3.5得到的光学标测用心肌片置于含10μM的Blebbistatin-Krebs溶液的样片浴槽中，平衡2min-3min，持续充入氧气和二氧化碳，保持温度为37℃；

步骤4.2：在光学标测系统上采用高频率相机分别采集电刺激和蓝光刺激后的电压信号和钙信号，即获取电刺激和蓝光刺激前后活体短轴心肌片的光学图像数据。

2.根据权利要求1所述的活体心肌片光学成像的方法，其特征在于，步骤1.1中，所述光遗传转基因成年小鼠由Pnmt-Cre转基因小鼠与loxp系统小鼠B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor^{tm27.1(CAG-COP4H134R/tdTomato)Hze}/J strain杂交获得。

3.根据权利要求2所述的活体心肌片光学成像的方法，其特征在于，所述Pnmt-Cre转基因小鼠是在Pnmt基因启动子上插入Cre重组酶，所述B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor^{tm27.1(CAG-COP4H134R/tdTomato)Hze}/J strain小鼠是在(ROSA)26位置插入了CAG-loxP-STOP-loxP-hChR2(H134R)-tdTomato。

4.根据权利要求1所述的活体心肌片光学成像的方法，其特征在于，步骤1.1中，所述麻醉采用腹腔内注射三溴乙醇、或者戊巴比妥钠、或者体积比为1:1的盐酸氯胺酮和速眠新Ⅱ的混合液中的一种；所述麻醉的时间为10min。

5.根据权利要求1所述的活体心肌片光学成像的方法，其特征在于，步骤1.1中，步骤1.2中，所述灌流的速度为3.5ml/min-4.0ml/min，时间为3min。