[发明专利]一种酮戊二酸的制备方法

权利要求书

1.一种酮戊二酸的制备方法，其特征在于，包括以下有效步骤：

a、对酮戊二酸基因工程菌进行高密度诱导发酵培养得到菌体酶，离心分离得到酮戊二酸菌体酶；

b、将分离得到的酮戊二酸菌体酶加入到转化罐中，同时，加入过氧化氢酶，35℃保温，400rpm，0.5vvm，罐压0.05Mpa；

c、将一水谷氨酸钠用自来水溶解后用蠕动泵流加入转化罐，流加速度为1.5升/小时，期间用1％盐酸控pH在6.5左右；

d、待转化结束后，将得到的转化液经过陶滤膜，超滤1000，超滤2500三套膜过滤，将其中的菌体及其他不溶性杂质去除；

e、将转化液过滤完成后，将得到的料液放入到钙化釜中，调节搅拌转速至200-250r/min，缓慢加入氢氧化钙固体，调节pH至3.4-3.6，当看到大量晶体析出时开始计时析晶1.5h，之后继续调节pH，用氢氧化钙调节pH至3.9-4.1，pH稳定后继续析晶2h，继续加入氢氧化钙，调节pH为5.4-5.6，当pH稳定后继续搅拌析晶1.5h，钙化后过滤，收集滤饼；

f、将得到的滤饼称重后，加入两倍湿滤饼量的水，开启搅拌，转速200-250r/min，将其分散开，分散均匀后，快速倒入配制好的15％硫酸，搅拌使其充分反应，调节pH至1.3-1.4，待PH稳定后保持此PH搅拌反应1h，将酸化液过滤，收集滤液，一倍滤饼量的去离子水分两次洗涤滤饼，第一次的合并至滤液，第二次的用作下一次酸化过滤的一次洗涤水，滤渣收集集中处理；

g、酸化后滤液加入0.3％液体量的活性炭，室温下持续搅拌2-3h进行脱色；

h、测量脱色后滤液pH、浓度、质量，过阳离子树脂柱，检测浓液出柱pH、浓度、质量，进阴柱；

i、测量过阳柱后滤液pH、浓度、质量，过阴离子树脂柱，检测滤液出柱pH、浓度、质量，进浓缩；

j、过柱后的料液进浓缩系统，加热50℃，极限真空，浓缩至波美度为20-21时停止，后梯度式降温进行结晶操作，温度降至20以下时进行离心操作；

k、将离心所得湿品装托盘进烘箱50度烘干，即可得到酮戊二酸。

2.根据权利要求1所述的酮戊二酸的制备方法，其特征在于，所述a步骤中，对酮戊二酸基因工程菌进行高密度诱导发酵培养得到菌体酶包括以下步骤：

a1、菌种活化:LB琼脂培养基在40℃左右加入25ug/ml卡那霉素，倒平板，冷却后平板划线，37℃培养过夜；

a2、一级种瓶:挑取活化好的单菌落至50mL/250mL的TB培养基中，加入25ug/ml卡那霉素，37℃，220rpm培养过夜；

a3、二级种瓶:在600ml/3000ml的TB培养基中加入25ug/ml卡那霉素，将长好的一级种瓶一对一接入，37℃，20rpm培养3.5-4h，OD大约3-4；

a4、发酵:培养基为高密度培养基，消前pH自然，121℃保温30min，冷却后37℃保温，接种前用氨水调pH至7.0，发酵过程用氨水调pH在7.0左右，接种量为5％，通气量为0.5vvm，整个发酵过程通过转速调节控制溶氧在20％以上；

a5、补料:当溶氧回升时开始补料，补料速率大约为15-20mL/h/升发酵液；

a6、诱导:当0D600达到15-20左右时加入IPTG诱导剂，浓度为0.2mM/L.诱导后降温至25℃培养；

a7、放罐:0D600达到60以上可以放罐。放罐料液放4℃冰柜保存；

a8、离心:带冷冻离心机400rpm离心30分钟，收集菌体，得到酮戊二酸菌体酶。

3.根据权利要求2所述的酮戊二酸的制备方法，其特征在于，所述b步骤中，酮戊二酸菌体酶的添加量为整个步骤中总质量的2％。

4.根据权利要求3所述的酮戊二酸的制备方法，其特征在于，所述c步骤中，一水谷氨酸钠的添加量为整个步骤中总质量的10％。