[发明专利]一种检测氯霉素的均相比色生物分析方法及其应用

说明书

本发明公开了一种检测氯霉素的均相比色生物分析方法及其应用，通过6条寡核苷酸链之间的DNA杂交反应分别构建两种Y型核酸限域体，进一步利用氯霉素核酸适配体与二者之间的杂交反应来抑制设计在两种Y型核酸限域体结构末端的类过氧化物DNA酶活性，由于氯霉素与其核酸适配体之间的特异性识别作用可引起上述DNA酶碱基序列的释放，进而结合氯化血红素形成DNA酶来实现其催化显色信号转导，以及显色产物吸光度与氯霉素分析物浓度之间的定量关系构建；本发明操作方便，成本低廉，选择性和灵敏度高，稳定性好，对于牛奶等复杂介质中氯霉素残留的快速检测具有很好应用价值。

技术领域

本发明涉及生物分析技术领域，具体是一种检测氯霉素的均相比色生物分析方法及其应用。

背景技术

作为一种可用于有效抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌活性的广谱性抗生素，氯霉素（CAP）被广泛应用于抵御各种细菌引起的感染。虽然CAP在临床医学上具有十分重要的作用，但近年来它的滥用引起的抗生素残留污染对人类健康带来了极大威胁。例如，从食物或药物中摄入过量的CAP会使骨髓生长被抑制从而导致再生障碍性贫血和白血病等血液疾病的发生，同时还会损害肝脏、肾脏造成人体抵抗力下降，出现过敏感染等多种副作用。因此，世界上多个国家已经严令禁止在食用动物和动物源性食品中使用CAP，并对食品中的CAP残留提出了严格标准。例如，欧盟将包括肉类、牛奶、水产养殖产品和蜂蜜等在内的各种食品中的CAP最大允许限制设定为0.3ng/g，我国也规定在动物性食品中不得检出氯霉素。然而，低成本和高效的抗感染能力使得CAP至今依然在某些行业被非法使用，从而导致其在牛奶、肉和蜂蜜等动物产品中的积累并可能通过食物链积聚在人体内，对人类健康构成潜在威胁。为此，发展各种可用于食品等复杂基质中CAP残留准确检测的分析方法具有十分重要的意义。

目前，国家标准一般采用高效液相色谱(HPLC)、气相色谱-质谱联用(GC-MS)、酶联免疫吸附实验、毛细管电泳等分离分析方法来进行抗生素的检测，但是该方法仪器昂贵，检测成本及对操作人员的技术要求高，且一般只能在实验室中进行，很难满足实际应用中实时、现场检测的需要。为了有效解决这一问题，近年来人们先后将抗原（抗体）、DNA等生物识别作用与电化学、比色等分析方法相结合，发展了大量可用于抗生素快速、方便检测的生物分析或生物传感方法。其中，与酶联吸附免疫分析(ELISA)等免疫生物分析方法中所使用的各种抗体相比，核酸适配体由于具有稳定性更好、成本更为低廉、生物识别特异性更强等优良性质，因而将其用作一种“人工抗体”来发展各种抗生素生物分析或生物传感方法具有十分独特的优势。

尽管近年来人们已经在基于核酸适配体生物识别作用的抗生素分析方法研究方面开展了大量卓有成效的工作，但是这些方法一般都是基于固相基底上的异相分析模式而构建的，因而往往需要十分繁琐的界面修饰与核酸适配体固定，以及多步温育、分离和洗涤操作，因而不仅分析时间较长，操作繁琐，而且多步操作还会在一定程度上影响方法的重复性。因此，基于核酸适配体的高特异性生物识别作用发展一种操作简单、性能优良的氯霉素生物分析新方法，并将该方法应用于氯霉素的检测中具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的就是针对目前检测抗生素的方法所面临的操作繁琐、分析成本较高等问题，提供一种检测氯霉素的均相比色生物分析方法，该方法全部操作均通过在均相溶液中混匀反应而进行，操作方便，成本低廉，灵敏度和稳定性好，分析智能化程度高，因而对于食品等复杂介质中CAP残留的现场、快速检测具有很好的应用价值。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

本发明的一种检测氯霉素的均相比色生物分析方法，包括以下步骤：

（1）制备核酸限域体复合物

依次将浓度为2μM的Y₁₁、Y₁₂和Y₁₃单链DNA各10μL和10μL的氯霉素适配体（aptamer）加入至PV管中，再置于95℃水浴中加热5min，自然冷却2h至室温，从而形成Y1-aptamer 具有限域效应的核酸复合物；