[发明专利]一种基于咔唑的双光子极性荧光探针及其制备方法和用途

说明书

本发明公开了一种基于咔唑的双光子极性荧光探针及其制备方法和用途，其中基于咔唑的双光子极性荧光探针的结构式如下：本发明双光子荧光探针的荧光量子产率和荧光寿命对极性响应具有良好的线性关系。此外，该荧光探针分子具有优秀的双光子吸收性能。细胞毒性测试表明该探针对于HeLa细胞几乎没有毒副作用，双光子共聚焦成像实验表明该探针具有很好的溶酶体定位能力和细胞渗透性，光稳定性好，适用于细胞溶酶体极性变化的长时间实时双光子荧光成像和可视化研究。

技术领域

本发明涉及一种双光子荧光探针及其制备方法和用途，具体地说是一种基于咔唑的双光子极性荧光探针及其制备方法和用途。

背景技术

极性是化学和生物学中重要的参数。在化学领域，极性是影响化学反应的关键参数。在生物学领域中，细胞的极性是细胞操作和调节机制的反馈，许多细胞活动，如脂肪形成分化，免疫反应激活，细胞迁移和死亡，以及分子跨细胞层转运，可能导致细胞极性的变异。因此，极性的异常变化与生物学障碍和疾病高度相关(例如，糖尿病，肝硬化等)。另外，细胞不同区域的极性是不相同的，各个亚细胞器中，极性也不一样。在细胞凋亡过程中，溶酶体极性可作为反应因子来观察细胞微环境变化。因此，极性敏感的荧光探针是研究体外和体内生物分子极性变化的强大化学工具。

溶酶体是大多数动/植物细胞中常见的亚细胞器，包含多种水解酶，它是一种动态细胞器，在膜融合过程中利用膜运输途径接受大分子。溶酶体中的一系列酸性水解酶可通过酶促反应降解这些大分子。它在维持细胞稳态方面发挥着重要作用，包括重新粘附受损细胞器，消化大分子，以及参与细胞内信号传导和质膜修复等。据报道，溶酶体的功能障碍与许多疾病相关，在溶酶体功能中起重要作用的膜流动性和酶促反应可以通过极性的变化来确定。

荧光探针由于具有灵敏度高、选择性好、易合成、廉价以及良好的生物应用等特点，已成为化学、环境和生命科学中重要的检测工具。迄今为止，检测溶剂以及细胞中极性的荧光探针相继被报道，然而大多数的探针是基于单光子激发的，单光子荧光探针一般具有自荧光干扰大，短波长激发对细胞的光毒性大，容易发生荧光自淬灭等缺点。与单光子荧光探针相比，双光子荧光探针具有很多明显的优点，如：细胞光毒性小，光稳定性强，时间空间分辨率高和组织渗透深度大。因而双光子荧光探针已经作为科研工作者研究的一个重要课题。

咔唑作为一种经典的荧光团，不仅具有大的共轭体系和共平面结构，而且具有良好的光稳定性和低毒性。到目前为止，以咔唑为荧光团的双光子极性荧光探针用于细胞凋亡过程中溶酶体极性监测的文献报道非常少见。

发明内容

本发明旨在提供一种基于咔唑的双光子极性荧光探针及其制备方法和用途，所要解决的技术问题是通过分子设计得到一种合适的荧光探针结构，使其具有较大的共轭体系和共平面结构，双光子吸收性能优异，高选择性和透膜性，低细胞毒性，高光稳定性和生物相容性等优点，以实现定量检测溶液的极性变化和双光子共聚焦成像检测细胞凋亡过程中溶酶体的极性变化。

本发明基于咔唑的双光子极性荧光探针，简记为PCT，以咔唑为母体，其结构式如下：

本发明基于咔唑的双光子极性荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：化合物1的合成

在500mL圆底烧瓶内，将KOH(260mmol，14.63g)溶解在适量丙酮(200mL)中，室温下搅拌30分钟，再加入丙酮溶解的3-溴咔唑(52mmol，2.80g)，室温下搅拌4个小时，最后缓慢加入丙酮溶解的溴乙烷(78mmol，6mL)，室温下搅拌过夜；反应结束后过滤掉KOH固体，旋转蒸发仪旋干，焦油状液体用适量的二氯甲烷溶解，硅胶制样，柱层色谱分离，用石油醚：二氯甲烷(PE：DCM，v/v，50：1)为淋洗剂，提纯得到化合物1，白色絮状固体，产物：11.12g，产率为：78％。

步骤2：化合物2的合成