[发明专利]一种猪圆环病毒3型感染性克隆的构建及鉴定方法

说明书

本发明公开了一种猪圆环病毒3型（PCV3）感染性克隆的构建方法及鉴定方法，构建时利用圆环病毒本身的特性，即PCV3的核酸为环状DNA，任何位置都可以看做是起始位点也可以看做是终点的特征，首先对PCV3的DNA序列进行重排，再对其进行改造。以往的研究仅是根据临床组织进行PCV3病毒的鉴定，对于检测病原的Western blot鉴定标准一直未见报道。因此，本发明在制备PCV3 Cap单克隆抗体的基础上，再进行感染性克隆的构建及鉴定。本发明方法不利用外源质粒获得PCV3感染性克隆，从而排除外源基因的感染；设计独特的检测引物，该引物仅能对环状PCV3 DNA进行PCR检测，对于成环前的PCV3 DNA不能进行PCR检测。PCR检测使用了PCV3的特异性单克隆抗体对其进行检测，实验数据更加可信。

技术领域

本发明属于微生物学领域，具体是一种通过人工手段获得猪圆环病毒3型（PCV3）病原，并公开猪圆环病毒3型感染性克隆的构建及鉴定方法。

背景技术

猪圆环病毒（PCV）长期威胁着我国养猪业的健康发展。以往的研究主要针对于猪圆环病毒2型（PCV2）的研究。近些年，新出现的猪圆环病毒3型（PCV3）对养猪业造成了巨大的经济损失。然而由于PCV3与PCV2的生长特性以及所感染的细胞系不同，当前对于PCV3的研究仅限于临床疾病检测领域。为了更好的防控PCV3感染，获得PCV3病原已迫在眉睫。

传统的感染性克隆的构建方法是将病毒的线性DNA构建到真核表达载体上，之后再转染于敏感细胞系，在真核表达载体启动子的驱动下，对病毒相应蛋白及调控元件进行转录及表达。病毒传统的感染性克隆的构建方法需要弄清病毒本身的调控区，并且解析病毒复制的机理及相应蛋白的功能。对于新出现的PCV3，有关其蛋白的功能，复制起始位点还需要进一步的研究。在不清楚PCV3相应蛋白功能以及起始位点的前提下，不能按照传统的病毒感染性克隆的构建方法对其进行包装拯救。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪圆环病毒3型（PCV3）感染性克隆的构建方法，以及使用独特创建的引物对其在基因水平上进行鉴定，并在蛋白水平上进行了进一步的验证。

本发明与以往研究不同的是，利用圆环病毒本身的特性，即PCV3的核酸为环状DNA，任何位置都可以看做是起始位点也可以看做是终点的特征，首先对PCV3的DNA序列进行重排，再对其进行改造。以往的研究仅是根据临床组织进行PCV3病毒的鉴定，对于检测病原的Western blot鉴定标准一直未见报道。因此，本发明在制备PCV3 Cap单克隆抗体的基础上，再进行感染性克隆的构建及鉴定，结果更加可信。

本发明一种猪圆环病毒3型（PCV3）感染性克隆的构建方法，包括如下步骤：

（1）将NCBI公布的猪圆环病毒3型线性DNA序列在snapgen软件上的成环；

（2）对猪圆环病毒3型成环后DNA独立酶切位点的筛选，筛选具有单一酶切位点的位置进行开环；

（3）对开环后的猪圆环病毒3型DNA序列进行改造，在开环后的线性DNA序列末端添加酶切位点，得到重排后的线性猪圆环病毒3型 DNA序列；

（4）通过分子生物学实验技术，对重排后的线性猪圆环病毒3型 DNA序列进行PCR扩增、纯化、酶切、纯化、连接、再纯化后构建完成。

构建方法步骤（4）所述的分子生物学实验技术为现有技术，对重排后的线性猪圆环病毒3型 DNA序列进行PCR扩增、纯化、酶切、纯化、连接、再纯化的方法均采用现有方法。

上述构建的猪圆环病毒3型感染性克隆的PCR鉴定方法，包括以下步骤：

（2.1）猪圆环病毒3型感染性克隆的Western blot检测；

（2.2）猪圆环病毒3型感染性克隆感染细胞后的形态观察；

（2.3）猪圆环病毒3型感染性克隆的PCR检测。