[发明专利]一种通过桃儿七愈伤不定根生产鬼臼毒素的方法

说明书

本发明公开了一种通过桃儿七愈伤不定根生产鬼臼毒素的方法，通过获取无菌种胚、胚性愈伤组织诱导、不定根的生长和鬼臼毒素的诱导生产等步骤，建立了一套耦合细胞工程和发酵工程的手段生产鬼臼毒素的方法。本方法操作简单，产量高，且愈伤组织不继代褐化程度低；通过桃儿七内生菌粉红粘帚霉fhnzm发酵液及一些植物生长调节剂处理不定根，有效提高了鬼臼毒素含量。

技术领域

本发明涉及农业和工业生物技术领域，具体的是一种通过桃儿七愈伤不定根生产鬼臼毒素的方法。

背景技术

桃儿七(Sinopodophyllum hexandrum Royle)是小檗科桃儿七属草本植物，国家三级保护植物，主要分布在我国西部2800米以上的林缘及灌丛中。由于自然资源的匮乏和濒危，被收录入《中华珍稀濒危植物名录》和《中国植物红皮书》。

桃儿七在民间主要用于痛疖肿毒、风湿性骨痛、气管炎等症，现代药学研究表明，其根及根茎中主要含有木脂素类、黄酮类、皂苷、多糖等成分，其中木脂素类的鬼臼毒素含量最高。鬼臼毒素具有广泛的药学活性，如0.5％鬼臼毒素酊在治疗尖锐湿疣方面具有起效快、治愈率高、安全性好等特点，1990年世界卫生组织推荐其为一线药物，1994年我国《国家基本药物》皮肤类抗病毒唯一入选药物。鬼臼毒素还是合成抗癌药物GP7、VP-16、VM-26、NK611 等及抗艾滋病药物的前体物质。

关于鬼臼毒素的来源主要是通过採挖野生桃儿七，从其根和根茎中提取，近年来，随着野生资源的锐减及封山育林等生态保护政策的实施，野生资源已经很难采挖。桃儿七人工驯化栽培已有很多报道，但栽培周期长、产量低、药材收购价格低，农民没有种植的积极性。通过桃儿七组培苗胚根及愈伤组织生产鬼臼毒素有零星报道，但桃儿七生根困难、胚根数量少、产量低、而且此法对桃儿七种子的消耗量很大；愈伤组织培养虽然可以通过愈伤的继代增加产量，但是愈伤组织生长缓慢、继代后容易褐化、最多继代2次，限制了此法的有效应用。通过桃儿七内生菌生产鬼臼毒素已有报道，但是内生菌发酵生产鬼臼毒素含量低、菌种稳定性差、随着菌种的传代生产鬼臼毒素的能力丧失。

发明内容

本发明的目的是针对以上技术问题，提供一种通过桃儿七愈伤不定根生产鬼臼毒素的方法。

本发明提供的一种通过桃儿七愈伤不定根生产鬼臼毒素的方法，是一种耦合细胞工程和发酵工程高效生产鬼臼毒素的方法，具体包括以下步骤：

(1)获取无菌种胚

将新鲜采集的桃儿七种子，除去虫蛀和霉烂种子，清洗干净后水选，用少许浓硫酸表面消毒、腐蚀种皮，0.5％的碳酸钠室温浸泡20小时除去油质、蜡质等疏水成分，80mg/L的赤霉素(GA4+7)4℃浸泡28小时，0.2％的升汞表面消毒6分钟。用无菌水反复冲洗，用灭过菌的滤纸吸干种子表面水分，将种子切开，取带胚的半粒种子待用。

作为优选，用灭过菌的尖嘴钳将种胚从种脐部的萌发孔中挤出待用。

(2)胚性愈伤组织诱导

将上述种胚接种于愈伤组织诱导培养基，在黑暗条件下，培养温度23℃，培养40天左右，至明显看到带有不定根根原基的胚性愈伤组织，获得外植体。

胚性愈伤组织诱导培养基配方1如下:MS基本培养液、蔗糖50g/L、酸水解酪蛋白1g/L、琼脂5g/L、生物素0.2mg/L、吲哚乙酸(IAA)2-4mg/L、玉米素(ZT)2-4mg/L、油菜素内酯(BR)0.01-0.05mg/L、毒莠啶(PIC)2mg/L

作为优选，吲哚乙酸(IAA)浓度为3mg/L，玉米素(ZT)浓度为3mg/L，油菜素内酯(BR)浓度为0.03mg/L。