[发明专利]一种通过桃儿七愈伤不定根生产鬼臼毒素的方法

权利要求书

1.一种通过桃儿七愈伤不定根生产鬼臼毒素的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）获取无菌种胚：将新鲜的桃儿七种子消毒，取出无菌种胚；

（2）胚性愈伤组织诱导：将上述种胚接种于胚性愈伤组织诱导培养基，黑暗条件下，23℃培养40天左右，至明显看到带有不定根根原基的胚性愈伤组织，获得外植体；

胚性愈伤组织诱导培养基配方: MS基本培养液、蔗糖50g/L、酸水解酪蛋白1g/L、琼脂5g/L、生物素0.2 mg/L、吲哚乙酸2-4mg/L、玉米素2-4mg/L、油菜素内酯0.01-0.05 mg/L、毒莠啶2 mg/L；

（3）不定根的生长：将上述外植体转接入不定根生长培养基，黑暗条件下，20℃培养40天，至不定根长度5cm；

不定根生长培养基配方：1/2MS基本培养液、蔗糖20g/L、琼脂5g/L、萘乙酸浓度为0.2mg/L、吲哚乙酸浓度为0.2mg/L；

（4）鬼臼毒素的诱导生产：将上述不定根接入鬼臼毒素诱导培养基，黑暗条件下，20℃培养7天，收集不定根，洗净烘干后，用体积比1:1的甲醇/氯仿混合液超声提取1h，过滤，挥干，甲醇定容，即为鬼臼毒素提取液；

鬼臼毒素诱导培养基配方： 1/2MS基本培养液、蔗糖20g/L 、粉红粘帚霉发酵液接种量为体积比20%；

其中粉红粘帚霉为fhnzm，保藏号为CGMCC No.17070，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心；

粉红粘帚霉发酵液制备：将粉红粘帚霉接入PDA培养基，30℃，160r/min振荡培养，培养9 d后取样，培养物经滤纸过滤，滤液3000 r/min离心15 min，上清液经 0.22 μm 滤膜过滤，收集滤液-20℃保存备用。

2.根据权利要求1所述的通过桃儿七愈伤不定根生产鬼臼毒素的方法，其特征在于所述步骤(1)无菌种胚的取出方法是将种胚从种脐部的萌发孔中挤出。

3.根据权利要求1所述的通过桃儿七愈伤不定根生产鬼臼毒素的方法，其特征在于所述步骤（2）中吲哚乙酸为3mg/L，玉米素为3mg/L，油菜素内酯为0.03mg/L。

4.根据权利要求1所述的通过桃儿七愈伤不定根生产鬼臼毒素的方法，其特征在于所述步骤（2）胚性愈伤组织诱导培养基配方中的毒莠啶2 mg/L用2,4-二氯苯氧基乙酸2 mg/L代替。

5.根据权利要求1所述的通过桃儿七愈伤不定根生产鬼臼毒素的方法，其特征在于所述步骤（2）胚性愈伤组织诱导培养基配方中的毒莠啶2 mg/L用独脚金内酯0.2-0.8 mg/L代替。

6.根据权利要求1所述的通过桃儿七愈伤不定根生产鬼臼毒素的方法，其特征在于所述步骤（4）鬼臼毒素诱导培养基配方中的粉红粘帚霉发酵液接种量为体积比20%替换为茉莉酸甲酯3 mg/L。

7.根据权利要求1所述的通过桃儿七愈伤不定根生产鬼臼毒素的方法，其特征在于所述步骤（4）鬼臼毒素诱导培养基配方中的粉红粘帚霉发酵液接种量为体积比20%替换为冠菌素0.01-0.1 mg/L。

8.根据权利要求4所述的通过桃儿七愈伤不定根生产鬼臼毒素的方法，其特征在于所述步骤（2）中吲哚乙酸为3mg/L，玉米素为3mg/L，油菜素内酯为0.03mg/L。

9.根据权利要求5所述的通过桃儿七愈伤不定根生产鬼臼毒素的方法，其特征在于所述步骤（2）中吲哚乙酸为3mg/L，玉米素为3mg/L，油菜素内酯为0.03mg/L，独脚金内酯为0.5mg/L。

10.根据权利要求7所述的通过桃儿七愈伤不定根生产鬼臼毒素的方法，其特征在于所述步骤（4）中冠菌素为0.05mg/L。