[发明专利]无细胞损失的微量免疫荧光检测方法

说明书

本发明公开了一种无细胞损失的微量免疫荧光检测方法，包括以下步骤：0.22um Spin‑X Centrifuge Tube灭菌；将细胞转移到灭菌过的0.22um Spin‑X Centrifuge Tube中直接进行后续步骤或者培养后进行后续步骤；后续步骤包括：PBS缓冲液冲洗、4％多聚甲醛固定、甲醇冰上处理、0.3M甘氨酸封闭液处理、4％BSA封闭液处理、荧光一抗室温避光孵育、DAPI染色液染色、过滤膜放于载玻片中封片，于激光扫描共焦显微镜下观察。该方法弥补了免疫荧光技术难以实现精确的筛选特定细胞的短板，为实现混合细胞群中筛选特定细胞提供一种简单精确以及可视化的技术。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及一种无细胞损失的微量免疫荧光检测技术。

背景技术

免疫荧光技术(immunofluorescence technique)是将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来，研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。其原理：先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿色或桔红色)，可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。

自从1941年Coons等利用荧光素对细胞进行标记并取得成功，随后经过不断改进与延伸，形成如今利用和抗原与荧光标记抗体特异性结合的免疫荧光技术。现如今免疫荧光技拥有特异性强、敏感性高、可视性好等优势，并成为生物化学、细胞学、植物学以及发育生物学等生命科学研究领域中不可或缺的科研技术。

免疫荧光可用于组织切片，培养的细胞系或单个细胞，并可用于分析蛋白质，聚糖和生物小分子和非生物分子的分布。这种技术甚至可以用于可视化结构，如中型长丝。如果尚未确定细胞膜的拓扑结构，则可以将表位插入蛋白质中与免疫荧光结合使用以确定结构。免疫荧光也可用作“半定量”方法，以深入了解DNA甲基化的水平和定位模式。免疫荧光可以与其他非抗体荧光染色方法组合使用，例如，使用DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)标记DNA。几种显微镜设计可用于免疫荧光样品的分析；最简单的是落射荧光显微镜，共聚焦显微镜也被广泛使用。还可以使用能够具有更高分辨率的各种超分辨率显微镜设计。

但是免疫荧光技术也存在一定的缺陷性，如免疫荧光仅限于固定(即死亡)细胞，因为当与荧光标记物反应时抗体不穿透细胞膜，必须使得细胞膜通透。并且抗原分子必须牢固地固定在细胞内自然定位的位置。同时在细胞标记荧光过程中要经历多次洗涤，无法避免试验过程中细胞的损失，难以鉴定出样品出微量的特殊细胞，因此限制了免疫荧光技术在细胞筛选中的应用。

传统的免疫荧光步骤为：

1、爬片：目的细胞胰酶消化后，用新鲜培养基吹打悬浮。取出载玻片平放在6孔板内，细胞接种到6孔板中，5％CO2培养箱培养24h，细胞贴附在载玻片上。

2、收片：细胞贴附24h后，去除培养基，加入预冷的1ml PBS洗片，重复三次。

3、固定；加入1ml的4％多聚甲醇，覆盖载玻片，冰上孵育10-15min,1ml PBS洗片3次。

4、透化：加入0.5ml的0.5％Triton-100，冰上孵育5min，PBS洗片3次。

5、封闭：常温下，加入2ml含2％BSA的PBS，孵育1h，PBS洗片1次。

6、一抗孵育：晾干载玻片，加入100ul稀释好的一抗，室温孵育2h，PBS洗涤3次。

7、二抗孵育：同一抗孵育。

8、染核：加入0.5mlDAPI工作液(1ug/ml，PBS稀释)，覆盖盖玻片，室温孵育5min。