[发明专利]无细胞损失的微量免疫荧光检测方法

权利要求书

1.无细胞损失的微量免疫荧光检测方法，其特征是包括以下步骤：

1）、0.22 um Spin-X Centrifuge Tube 灭菌；

2）、将细胞0.5ml转移到步骤1）所得的灭菌过的0.22 um Spin-X Centrifuge Tube 中直接进行后续步骤3）或者培养后进行后续步骤3）；

3）、对步骤2）所得物进行离心，除去离心所得的液体后，再加入0.5±0.05ml pH 7.4的PBS缓冲液进行冲洗后离心，除去离心所得的液体；

再重复上述加入0.5±0.05 ml pH 7.4的PBS缓冲液进行冲洗后离心，除去离心所得的液体；重复次数为1~3次；

4）、向步骤3）所得物中加入4%多聚甲醛0.5±0.05ml于室温下固定10~15 min，然后离心去除上层液体；

5）、向步骤4）所得物中加入0.5±0.05ml pH 7.4的PBS缓冲液进行冲洗后离心，除去离心所得的液体；

再重复上述加入0.5±0.05ml的PBS缓冲液进行冲洗离心，除去离心所得的液体；重复次数为2~4次；

6）、向步骤5）所得物中加入0.5±0.05ml甲醇于冰上放置1±0.2min ，再离心去除液体，

然后用0.5±0.05ml pH 7.4的PBS缓冲液冲洗，除去离心所得的液体，

再重复上述加入0.5±0.05ml pH 7.4的PBS缓冲液冲洗后离心，除去离心所得的液体；重复次数为1~3次；

7）、向步骤6）所得物中加入0.3M 甘氨酸封闭液0.5±0.05ml，于室温下封闭20±5min，离心，除去离心所得的液体；

8）、向步骤7）所得物中加入4% BSA封闭液0.5±0.05 ml于室温下封闭2h~4h；

9）、向步骤8）所得物中加入特异性的荧光一抗0.5±0.05ml，于室温避光孵育至少2小时；

10）、向步骤9）所得物中加入0.5±0.05ml pH 7.4的PBS缓冲液进行冲洗，离心，除去离心所得的液体；

再重复上述加入0.5±0.05 ml pH 7.4的PBS缓冲液进行冲洗后的离心，除去离心所得的液体；重复次数为2~4次；

11）、向步骤10）所得物中加入0.5±0.05ml的 DAPI染色液，混匀，室温放置3-5分钟；

12）、向步骤11）所得物中加入0.5±0.05 ml pH 7.4的PBS缓冲液进行冲洗，离心，除去离心所得的液体；

再重复上述加入0.5 ml pH 7.4的PBS缓冲液进行冲洗后的离心，除去离心所得的液体；重复次数为2~4次；

13）、取出步骤12）所得的0.22 um Spin-X Centrifuge Tube的过滤膜，放于载玻片中，封片；封片采用pH 7.4的PBS缓冲液配制的90%甘油；

于激光扫描共焦显微镜下观察，或于4℃避光保存。

2.根据权利要求1所述的无细胞损失的微量免疫荧光检测方法，其特征是：

所述步骤9）的荧光一抗为Anti-HLA Class [MEM-147] abcam。

3.根据权利要求2所述的无细胞损失的微量免疫荧光检测方法，其特征是：

所述步骤2）中：于37℃，5%CO₂培养直至细胞贴附在滤膜上。

4.根据权利要求1~3任一所述的无细胞损失的微量免疫荧光检测方法，其特征是：

步骤3）冲洗时间为2±0.5分钟；

步骤5）、步骤6）、步骤10）、步骤12）的冲洗时间为5±1分钟。

5.根据权利要求1~3任一所述的无细胞损失的微量免疫荧光检测方法，其特征是：

所述离心为1500±300g 离心60±10s。