[发明专利]一种慢病毒转染囊胚滋养层细胞研究其基因功能的方法

说明书

本发明公开了一种慢病毒转染囊胚滋养层细胞研究其基因功能的方法，包括如下步骤：培养碟的制备：取20.83uL胚胎培养液置于离心管中，加入1uL慢病毒，吹打混匀；再将胚胎培养液在培养皿中做培养滴，并加入3mL矿物油，将培养皿放在培养箱平衡3‑5h。慢病毒转染囊胚：用胚胎培养液将去除透明带后的囊胚清洗干净；清洗好的囊胚置于培养碟中，转染10‑14h；用DPBS液体将囊胚清洗干净，并用4％PFA固定10‑30min，再用DPBS清洗干净；DAPI染核，压片。本发明通过慢病毒转染实现干扰滋养层细胞中目的基因表达，从而有效地解决滋养层细胞中基因不能敲低或过表达的问题。

技术领域

本发明属于胚胎工程领域，具体是一种慢病毒转染囊胚滋养层细胞研究其基因功能的方法。

背景技术

随着胚胎工程技术的发展和成熟，卵母细胞已实现体外培养、体外受精、以及克隆胚胎的生产和培养，而这些技术的实现都必须经过早期胚胎发育这个重要环节。早期胚胎发育是指受精卵到胚胎与母体子宫建立直接结构联系之前的胚胎发育过程。在这个过程中受精卵会经过多种生物学变化，比如：2-cell、4-cell、8-cell、桑椹胚和囊胚，而在早期胚胎发育过程中囊胚的形成比较特殊。随着胚胎的进一步发育，卵裂球发生内化并形成一个含有液体的腔体(即囊胚腔)，至此囊胚初步形成。随后囊胚会进一步扩大，导致透明带破裂，胚胎从其中伸展出来，形成孵化囊胚。通常，囊胚会分为早期囊胚、扩张囊胚、孵化囊胚。而囊胚形成的过程中，还伴随着谱系分化的发生。在第一次谱系分化中，先是外周细胞形成滋养外胚层(trophectoderm，TE)，然后是内部细胞集群形成内细胞团(inner cell mass，ICM)。紧接着，在囊胚着床之前会发生第二次谱系分化，主要是内细胞团继续分化为原始内胚层和原始外胚层。

在猪早期胚胎发育的发现，CDX2会在早期囊胚TE细胞中特异性表达，并且这种表达是依赖于YAP的核定位和胚胎的极化，同时CDX2的表达也是不同步。还有发现CDX2是维持猪TE细胞增殖和细胞极性所必需的，同时在猪第6.5天的囊胚中也需要EOME、SOX2和NANOG适当的表达。可见，这些多能性因子对于滋养外胚层和内细胞团的形成起到重要调控作用。为了滋养外胚层某个基因的功能，就需要特异性地该基因在囊胚中的作用。通过特异性地敲低或过表达，来观察其对囊胚和滋养外胚层的影响，但是添加抑制剂或激活剂以及显微注射等实验操作是无法解决这个问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种慢病毒转染囊胚滋养层细胞研究其基因功能的方法，来研究滋养层细胞的多能性因子对于囊胚的形成和分化的作用，以及这些滋养层细胞的基因在早期胚胎发育中的重要作用等科学问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种慢病毒转染囊胚滋养层细胞研究其基因功能的方法，包括如下步骤：

(1)培养碟的制备：

取20.83uL胚胎培养液置于离心管中，加入1uL慢病毒，吹打混匀；再将胚胎培养液在培养皿中做培养滴，并加入3mL矿物油，将培养皿放在培养箱平衡3-5h。

(2)慢病毒转染囊胚

①挑选质量相同的扩张囊胚，去除囊胚最外层的透明带；

②用胚胎培养液将去除透明带后的囊胚清洗干净；

③把清洗好的囊胚置于步骤(1)制得的培养碟中，转染10-14h；

④用DPBS液体将囊胚清洗干净，并用4％PFA固定10-30min，再用DPBS清洗干净；

⑤DAPI染核，压片。

优选地，步骤(1)中，培养箱内的温度为38.5℃，CO₂的体积分数为5％。

优选地，步骤(1)中，培养皿放在培养箱平衡4h。