[发明专利]一种聚乙二醇修饰的聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金颗粒负载CpG ODN的制备方法

说明书

本发明涉及一种聚乙二醇修饰的聚酰胺‑胺树状大分子包裹纳米金颗粒负载CpG ODN的制备及激活免疫细胞的方法，包括将聚酰胺‑胺树状大分子溶于溶剂，加入mPEG‑COOH，再先后加入氯金酸溶液和硼氢化钠溶液，经透析、冷冻干燥，得到{(Au⁰)₂₅‑G5.NH₂‑mPEG₂₀}；再与CpG ODN复合，即得。本发明制备工艺周期短，易于操作；材料在使用剂量下毒性低，生物相容性好，很好地压缩CpG ODN，能有效刺激BMDC细胞的成熟，成熟的BMDC细胞可有效激活T细胞，为非病毒性载体在肿瘤免疫治疗上的应用提供了参考。

技术领域

本发明属于肿瘤免疫治疗领域，特别涉及一种聚乙二醇修饰的聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金颗粒负载CpG ODN的制备方法。

背景技术

癌症是威胁我国健康的主要疾病之一。其发病率现已高居我国居民病死原因首位。癌症的早期发现、早期诊断及早期治疗是降低死亡率及提高生存率的主要策略之一。目前，手术治疗、放疗和化疗等是当前针对恶性肿瘤普遍采用的方法，但存在肿瘤的转移，以及放化疗不良反应等问题。由于免疫学和肿瘤生物学研究的飞速发展，免疫治疗成为了继经典的三大肿瘤治疗方式之后的第四种肿瘤治疗方式，并被2013年“科学期刊”评选为十大突破之一。肿瘤免疫疗法旨在激活人体的免疫系统，并依靠其自身的免疫功能来杀死癌细胞和肿瘤组织。

非病毒载体系统中，树状大分子能作为一种理想的纳米材料应用于基因传递系统。其区别于传统的线性聚合物类纳米材料，具有独特的高度支化三维立体结构，有良好的单分散性。树状大分子经过各种表面化修饰，如聚乙二醇化、乙酰化和烷基化等，产生了不同的理化性质。研究表明，第五代树状大分子有一定的细胞毒性，但是与纳米金颗粒形成复合物[Shan Y.,Luo T.,Peng C.,et al.,Gene delivery using dendrimer-entrappedgold nanoparticles as nonviral vectors[J].Biomaterials,2012,33(10):p.3025-3035.]会降低载体的毒性。

树突状细胞起源于造血干细胞，是目前发现的一类功能最强大的并可以激活未致敏初始型T细胞抗原提呈细胞，因此DC被称为是免疫系统的“哨兵”。大量的研究已经证明了DC在肿瘤形成、进展以及机体抗肿瘤中的作用，尤其是2010年第1个以DC为基础的DC疫苗产品获得美国食品和药品管理局批准用于治疗前列腺癌以来，以DC为基础的肿瘤免疫治疗正成为国内外研究的热点之一。成熟DC能有效的激活B细胞和T细胞，特别是CD8+ T细胞，激发机体产生抗肿瘤免疫应答反应。人工合成的非甲基化的CpG寡核苷酸是一种近年来引起广泛关注的激活剂。它可以激活TLR9，刺激DC分泌IL-12p70、TNF-α、IFN-5等细胞因子，从而激活T细胞，诱导产生抗肿瘤免疫反应。

检索国内外相关文献和专利结果表明：聚乙二醇修饰聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金颗粒作为基因载体负载CpG ODN，刺激树突状细胞的成熟，再利用成熟的树突状细胞激活T细胞，从而进行癌症的免疫治疗尚未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种聚乙二醇修饰的聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金颗粒负载CpG ODN的制备方法，聚酰胺-胺树状大分子与纳米金颗粒复合物作为非病毒载体负载CpG ODN，该方法制备过程简单，实验条件温和，易操作；该方法得到的复合物具有良好生物相容性、细胞免疫安全性以及高效基因转染效率，可有效刺激BMDC成熟，在恶性肿瘤的基因治疗等方面有较好的应用前景。

本发明提供了一种聚乙二醇修饰的聚酰胺-胺树状大分子包裹纳米金颗粒负载CpG ODN的制备方法，包括：