[发明专利]一种辣木叶肉原生质体及其制备方法

说明书

本发明公开了一种辣木叶肉原生质体及其制备方法。该制备方法以辣木三周龄从茎尖往下数第一分支与第二分支叶片为材料，采用纤维素酶R‑10和果胶酶R‑10进行酶解，先真空抽滤45‑50分钟，再使用30rpm水平摇床避光酶解5‑5.5小时，40μm的细胞筛过滤酶解后产物，并利用密度梯度自沉淀法冰上静置两小时分离原生质体。本发明克服了辣木原生质体小、分离效率低、杂质多等问题，有效建立了辣木叶肉原生质体高效且快速的制备方法。

技术领域

本发明属于细胞生物技术领域，具体涉及一种辣木叶肉原生质体及其制备方法。

背景技术

原生质体培养技术作为植物细胞工程的重要组成部分，被广泛应用于植物的遗传、育种学、基因工程研究领域。近年来，植物原生质体被广泛用于蛋白的亚细胞定位、蛋白-蛋白互作、蛋白-DNA互作反应、胞内蛋白运输机制、制备转基因植物(原生质体脱分化形成愈伤组织；再分化成完全植株)、通过原生质体融合技术培养体细胞杂交体等许多领域。

辣木(Moringa oleifera)全身是宝，叶片、果荚中富含多种矿物质、维生素，食用有增进营养和保健功能；种子中油脂含量高且含有有活性絮凝成分，有净水功能；根部含有生物碱，尤其是辣木碱有明显的杀菌作用；树干是造纸工业很好的原料。然而，辣木作为具有独特经济价值的多年生植物，国内外却没有关于辣木叶肉原生质体制备的方法。此外，采用现有的拟南芥、水稻或者其他植物的原生质体制备方法，得到的辣木叶肉原生质体出现数量少、细胞碎片多、大小不均匀等问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种快速高效的辣木叶肉原生质体的制备方法以及由该方法制备得到的辣木叶肉原生质体。

本发明通过测定辣木原生质体大小确定细胞筛孔径大小，比较离心法与密度梯度自沉淀法来确定辣木叶肉原生质体更适合密度梯度自沉淀，并通过梯度实验摸索最适合的自沉淀时间，具体的，本发明的辣木叶肉原生质体制备方法包括如下步骤：

(1)取辣木幼苗从茎尖往下数第一分支与第二分支叶片，在超净工作台中去除叶片两端1.5-2mm部分，留中间部分叶片切成0.3-0.4mm条状细丝，并马上将切下的细丝放置在渗透剂中，暗条件下放置；

(2)在室温下，用镊子将全部叶片细丝转移到酶解液中，真空抽滤45-50min，然后置于水平摇床上避光酶解5-5.5h，往酶解产物中加入预冷的W5溶液，混匀，然后经细胞筛过滤至圆底无菌离心管，冰上静置，待溶液出现明显分层，吸去上清，得到辣木叶肉原生质体。

进一步地，将得到的辣木叶肉原生质体使用预冷的W5溶液重悬，进行镜检。

上述步骤(1)的渗透剂为0.5mol/L甘露醇水溶液，所述的渗透剂用量为15mL/25片叶子。

步骤(2)的酶解液含有15mg/mL纤维素酶R-10、3mg/mL果胶酶R-10、0.4M的甘露醇、20mM的氯化钾，20mM pH5.7的MES、10mM无水氯化钙、1mg/mL BSA、5mMβ-巯基乙醇，溶剂为超纯水。

所述的酶解液制备步骤为：将纤维素酶R-10、果胶酶R-10、甘露醇、氯化钾、pH5.7的MES混合，用超纯水定容到10mL，55℃水浴10min，冷却后加入无水氯化钙、BSA、β-巯基乙醇，混匀，加入超纯水定容到15mL，用0.45μm滤膜过滤灭菌，得到酶解液。

步骤(2)的在水平摇床上避光酶解是将含有叶片细丝的酶解液置于10cm的无菌培养皿，包上锡箔纸、30rpm避光酶解。

步骤(2)的W5溶液含有5mM葡萄糖、154mM氯化钠、125mM氯化钙、5mM氯化钾、2mMpH5.7MES，溶剂为超纯水。

步骤(2)的细胞筛孔径大小为40μm。

步骤(2)的细胞筛在过滤前用4-5mL的预冷W5溶液过滤，起到湿润细胞筛的作用。