[发明专利]一种变形链球菌生物膜形成量的检测方法及应用

说明书

本发明公开了一种变形链球菌生物膜形成量的检测方法，包括以下步骤：(11)将磁力搅拌子A浸没于唾液中进行孵育；(12)吸起磁力搅拌子A，淋洗后取下，置于24孔板培养孔中；(13)加入BHI液体培养基、变形链球菌菌悬液、待测样品溶液，再次孵育；(14)吸起磁力搅拌子A，淋洗后取下，置于24孔板的培养孔中自然风干；(21)加入结晶紫溶液染色，吸起磁力搅拌子A，淋洗后取下，置于24孔板的培养孔中自然风干；(22)加入无水乙醇脱色后转移至96孔板内，用酶标仪测定OD_600nm。还公开了该方法在筛选变形链球菌生物膜抑制剂中的应用。本发明方法操作简单、成本低廉，且数据的稳定性与灵敏度高，具备良好的应用前景。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种变形链球菌生物膜形成量的检测方法及应用。

背景技术

龋病，俗称虫牙、蛀牙，是一种源于细菌性感染的口腔主要常见疾病，严重时可继发牙髓炎和根尖周炎，甚至会引起牙槽骨和颌骨炎症,作为一种普遍存在于儿童和成人中的慢性口腔传染病，其成因与变形链球菌(Streptococcus mutans)在牙齿表面的定殖有着密切的联系。现代医学研究认为，变形链球菌生物膜吸附其他细菌在牙釉表面所形成的牙菌斑也是致龋的关键因素之一，减少或抑制生物膜的形成同样可达到防治龋齿的目的。生物膜形成量的测定是开展研究工作与评价治疗效果的重要手段，而目前测量生物膜的方法缺点有：灵敏度低、成本高，操作复杂、平行样本的数据重现性差。因此，寻找一种灵敏度高、成本低廉、操作简易、稳定性高的检测方法是当务之急。上述这些都是本领域技术人员亟待解决的问题。

发明内容

基于上述技术问题，本发明提供了一种变形链球菌生物膜形成量的检测方法，还提供了该检测方法在筛选变形链球菌生物膜抑制剂中的应用。

具体的，提供了一种变形链球菌生物膜形成量的检测方法，包括以下步骤：

(1)变形链球菌生物膜的形成：

(11)将磁力搅拌子A浸没于唾液中进行孵育；

(12)用磁力搅拌子B吸起磁力搅拌子A，以PBS缓冲液淋洗后，取下磁力搅拌子A，置于24孔板的培养孔中；

(13)向培养孔中加入BHI液体培养基、变形链球菌菌悬液、待测样品溶液，再次孵育；

(15)用磁力搅拌子B吸起磁力搅拌子A，以PBS缓冲液淋洗后，取下磁力搅拌子A，置于24孔板的培养孔中，自然风干；

(2)变形链球菌生物膜的检测：

(21)向培养孔中加入结晶紫溶液染色完全后，用磁力搅拌子B吸起磁力搅拌子A，以PBS缓冲液淋洗去除多余的染色液，取下磁力搅拌子A，置于24孔板的培养孔中，自然风干；

(22)向培养孔中加入无水乙醇脱色，取200～300μL转移至96孔板内，用酶标仪测定OD_600nm，即为量化后的变形链球菌生物膜形成量。

进一步的，步骤(11)中，所述磁力搅拌子A的规格为5×10mm，且经沸水浴12～18min的无菌处理。

进一步的，步骤(11)中，所述唾液取自正常人唾液且经过10000g离心12～18min及0.22μm滤膜过滤的无菌处理；所述孵育的温度为25～45℃，时间为2～6h。

进一步的，步骤(12)中，所述磁力搅拌子B的规格为10×50mm，且经沸水浴12～18min的无菌处理。

进一步的，步骤(12)中，所述PBS缓冲液的质量浓度为10mM，pH为7.0。