[发明专利]一种适用于猪流行性腹泻病毒培养的仔猪肠道上皮细胞快速制备方法

说明书

本发明涉及一种适用于猪流行性腹泻病毒培养的仔猪肠道上皮细胞快速制备方法。包括以下步骤：取新生仔猪小肠肠道，剪成肠断，纵向剖开，用磷酸盐缓冲液反复清洗；刮取肠腔面的肠上皮组织用DMEM/F12不完全培养基分散细胞团，离心清洗细胞；用DMEM/F12完全培养基悬浮细胞，调整细胞团密度，在37℃浓度5%二氧化碳气体条件下培养，得到生长成片细胞团；加入胰酶消化液，进行细胞纯化，纯化过程可反复进行，直至得到生长状态良好的仔猪肠道上皮细胞。本发明通过肠腔面的机械分离和纯化得到生长状态良好的仔猪肠道上皮细胞，所获得的肠道上皮细胞适用于猪流行性腹泻病毒培养，为研究猪流行性腹泻病毒感染对仔猪肠道上皮细胞的细胞和分子机制提供快速的技术方案。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种适用于猪流行性腹泻病毒培养的仔猪肠道上皮细胞快速制备方法。

背景技术

小肠上皮细胞是动物体内最重要的消化吸收细胞，在仔猪肠道营养吸收和肠道免疫调控发挥重要作用。猪的肠道上皮细胞分离培养成为深入研究小肠上皮细胞功能、病理和细胞分化的重要工具。猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）主要引起仔猪的一种急性、高度传染性的肠道疾病，其特征性的临床症状为急性肠炎、水样腹泻、呕吐和脱水，各年龄段的猪均可感染，其中仔猪发病率及病死率极高，严重影响养猪业的发展。PEDV经口鼻感染后直接进入猪的消化系统，侵染的靶细胞就是猪的肠道上皮细胞，PEDV在肠道上皮细胞内增殖复制，破坏了上皮细胞的正常形态，导致细胞出现病理损伤。

长期以来，在研究猪的肠道上皮细胞的生物学功能、细胞增殖分化、物质吸收代谢和肠道免疫与病理研究等多采用肠道永生化或肿瘤化的细胞系，但是永生化或肿瘤化的细胞系，其生物学特征与正常的细胞有很大的差异，因此使用细胞系作为研究对象来解释正常细胞的生理特性，具有明显的不足。原代细胞是从动物个体的组织器官中分离，其生物学特性变化较少，更接近与体内的生长特性，是比细胞系更好的研究材料。

仔猪肠道上皮细胞原代培养中普遍存在三个问题，一是细胞分离后活性差，细胞增殖缓慢。二是肠道微生物很多，肠粘膜中的隐窝、绒毛很多，难以将肠道微生物完全去除，在分离培养过程中极易受到微生物污染，从而造成细胞培养失败。三是所获得的分离细胞中存在不同程度的成纤维细胞污染。肠道上皮细胞原代常用的是螯合物分离法和酶消化法。螯合物分离法和酶消化法可获得分离的单一肠道上皮细胞，但对细胞的损伤较大，分离后细胞的活性较低。例如一种公开号为CN 106676059A的发明专利公开了一种仔猪肠道上皮细胞分级分离方法，通过向肠道中灌注细胞分离液根据孵育时间由前至后收集的不同部位的上皮细胞，该方法的优点在于可以收集不同分化阶段的肠道上皮细胞用于研究。但该方法也存在以下不足之处，一是仔猪日龄的选择是0～70日龄，仔猪在采食初乳后肠道微生物就会大量的定植，想要在细胞分离过程中完全去除几乎是不可能达到的。二是该方法采取的肠断很长，达到60～90cm，并且需要在水浴中震荡，操作困难、繁琐，在水浴过程中也很有可能造成二次污染。三是该方法细胞分离液属于螯合剂长时间的处理会对分离细胞造成损伤，致使细胞的活性降低。低增殖活性的仔猪肠道上皮细胞无法满足猪流行性腹泻病毒的培养需要。

因此有必要构建一种操作简单、高效、细胞活性强的仔猪肠道上皮细胞培养方法克服现有技术的不足。

发明内容

为了解决目前仔猪肠道上皮细胞分离过程中的不足，本发明提供一种操作简单易行、微生物污染风险小、细胞活性高，适用于猪流行性腹泻病毒培养的仔猪肠道上皮细胞快速制备方法。

一种适用于猪流行性腹泻病毒培养的仔猪肠道上皮细胞快速制备操作步骤如下：

（1）制备洁净肠断

取0日龄未吃初乳的新生仔猪小肠肠道50～60cm，将肠道剪成5～7cm的肠断，去除肠系膜，在磷酸盐缓冲液中将肠断纵向剖开，反复清洗肠断3～5遍，直至清洗液变成清亮，得到洁净肠断；

（2）制备接种细胞团