[发明专利]一种适用于猪流行性腹泻病毒培养的仔猪肠道上皮细胞快速制备方法

权利要求书

1.一种适用于猪流行性腹泻病毒培养的仔猪肠道上皮细胞快速制备方法，其特征在于操作步骤如下：

（1）制备洁净肠断

取0日龄未吃初乳的新生仔猪小肠肠道50～60cm，将肠道剪成5～7cm的肠断，去除肠系膜，在磷酸盐缓冲液中将肠断纵向剖开，反复清洗肠断3～5遍，直至清洗液变成清亮，得到洁净肠断；

（2）制备接种细胞团

在DMEM/F12不完全培养基中，刮取肠断内面的上皮组织，将刮取物用移液枪头反复吹吸分散细胞团，离心收集细胞团，重复清洗3次，既得接种细胞团；

（3）细胞培养

调整接种细胞团密度为25cm²细胞瓶有150～200个细胞团块，在DMEM/F12完全培养基中培养15～20天，得到生长成片细胞团；

（4）细胞纯化

在生长成片细胞团中加入胰酶消化，用DMEM/F12完全培养基终止消化反应，用移液枪头轻轻吹打细胞面，并吸除含成纤维细胞的细胞液；利用成纤维细胞与生长成片细胞胰酶消化时间差实现纯化，得到生长状态良好的仔猪肠道上皮细胞。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述新生仔猪为0日龄未吃初乳的新生仔猪。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述磷酸盐缓冲液由下列物质：氯化钠8g/L、氯化钾0.4g/L、磷酸二氢钾0.06g/L、十二水合磷酸氢二钠0.08g/L、碳酸氢钠0.35g/L、头孢噻呋钠1g/L、庆大霉素50mg/L和蒸馏水配制而成，pH值为7.2～7.4，经0.22uL滤膜过滤除菌。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，用2片玻璃载玻片的窄边对肠道内面进行刮取细胞团，用1mL移液枪头反复吹吸分散细胞团；转速1000r/min条件下离心5min，收集细胞团，用DMEM/F12不完全培养基反复清洗细胞团3次。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述DMEM/F12不完全培养基由下列物质：DMEM/F12培养液500mL、100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素、15ng/mL表皮生长因子和5mL 100倍浓度胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂配制而成。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，在DMEM/F12完全培养基中、温度37℃、浓度5%的CO₂气体的培养箱中，培养48h；更换细胞培养液，去除未贴壁细胞团；继续培养15～20天；得到生长成片细胞团。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）或（4）中，DMEM/F12完全培养基由下列物质：DMEM/F12培养液500mL、25mL胎牛血清、100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素、15ng/mL表皮生长因子和5mL 100倍浓度胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂配制而成。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（4）中，将25cm²细胞瓶中生长成片细胞团用3mL磷酸盐缓冲液润洗细胞贴壁面2次；在润洗后的生长成片细胞团中加入1mL浓度为 0.1%胰酶消化液，37℃条件下消化；消化过程中注意观察细胞形态，成纤维细胞消化1～2min变圆脱落，肠道上皮细胞在5～6min变圆脱落，在消化3min时，倾去消化液，加入DMEM/F12完全培养基2mL终止消化反应，用1mL移液枪头轻轻吹打细胞面，吸除含杂细胞的细胞液，再加入DMEM/F12完全培养基5mL继续培养，至此完成一次细胞纯化；如仍有成纤维细胞，可重复进行上述细胞纯化操作，直至得到生长状态良好的仔猪肠道上皮细胞。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：细胞培养用25cm²细胞瓶经浓度为10ug/cm² I型胶原包被，使用前用磷酸盐缓冲液清洗细胞瓶2次。

10.利用权利要求1制得的仔猪肠道上皮细胞进行猪流行性腹泻病毒培养的方法，其特征在于具体操作如下：

当纯化的仔猪肠道上皮细胞在25cm²细胞瓶内的铺壁率为80～90%时，用磷酸盐缓冲液润洗2次，加入猪流行性腹泻病毒液1mL和浓度0.1%的胰酶消化液10uL，孵育2～3h；孵育期间每隔10分钟摇晃细胞瓶，使病毒液均匀铺于细胞贴壁面，孵育结束吸出孵育液，加入6mL不完全DMEM/F12培养基和0.1%的胰酶消化液60uL继续培养3～4天，或出现明显的细胞病变，将细胞瓶取出，将细胞液和细胞进行反复冻融2次后收集猪流行性腹泻病毒液。