[发明专利]一种大麻素类活性物质的通用检测方法及其检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种大麻素类活性物质的通用检测方法及其检测试剂盒，检测试剂盒分为检测组试剂和对照组试剂两种成分，检测组试剂包括稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系CB1·copGFP/293和细胞内游离钙离子检测荧光探针试剂Fura Red，对照组试剂包括空白对照单克隆细胞系copGFP/293和细胞内游离钙离子检测荧光探针试剂Fura Red；所述空白对照单克隆细胞系copGFP/293的制备方法为：将pCDH‑CMV‑MCS‑EF1‑copGFP质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染至慢病毒包装细胞293V，制备EF1‑copGFP慢病毒，将EF1‑copGFP慢病毒感染人胚肾细胞293，得到空白对照单克隆细胞系copGFP/293。本发明通过检测胞质内游离钙离子浓度变化，以荧光钙的荧光值(Casupgt;2+/supgt;F)与copGFP的荧光值(PF)的比值Casupgt;2+/supgt;F/PF参数作为判定依据，实现对大麻素类活性物质快速、灵敏、精确的检测和定量分析。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种大麻素类活性物质的通用检测方法及其检测试剂盒。

背景技术

对于吸毒人员吸食大麻类精神物质的检测和监管一直是各国监管部门的难题。因为目前的检测手段主要依赖于抗体(如抗四氢大麻抗体)的免疫法，包括层析法、ELISA法等；以及气质联用、液质联用等大型仪器分析。但大麻类在人体内代谢较快，造成检测样本中目标检测成分含量极低，无法检测到。另一方面，新型合成大麻素层出不穷，且分子结构多样，使基于抗体的免疫检测法几乎不可能，甚至气质联用、液质联用也无法检测。

发明内容

针对现有技术存在的上述技术问题，本发明的目的在于提供一种大麻素类活性物质的通用检测方法及其检测试剂盒。

本发明构思为：无论是天然大麻素，还是各种各样的合成大麻素，其在机体内都会作用到大麻素受体这个靶点，从而产生其生物学效应。大麻素受体至少包括CB1、CB2两种类型，CB1主要存在于中枢神经系统中。大麻素受体属于GPCR类，当受到大麻素类分子激动剂作用后信号通路激活，即通过IP3-DAG信号通路使内质网内储存的Ca²⁺迅速释放到的细胞质，胞质内游离钙离子浓度升高，从而产生细胞应答。由于有非常多的钙离子指示剂可用于胞质内游离钙离子浓度的测定，因而我们通过建立同时表达绿色荧光蛋白copGFP稳转CB1的细胞系，以copGFP为内参质控，Fura Red为钙离子荧光指示剂；单波长激发，双波长检测，以荧光钙与copGFP的荧光比值为测定参数，建立一种新型的快速简便、高效精准、高通量通用的大麻素类活性物质检测方法。

所述的一种大麻素类活性物质的通用检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将大麻素受体基因CB1克隆到一个含有EF1启动表达荧光蛋白的载体的CMV启动子下，构建表达质粒；

2）将步骤1）构建的带荧光蛋白基因的质粒转染到真核永生化细胞，并建立EF1-荧光蛋白基因稳转细胞系，进行培养扩增得到检测组培养液；同样建立转染空白对照质粒，建立空白对照EF1-荧光蛋白基因稳转细胞系，进行培养扩增得到对照组培养液；

3）步骤2）检测组培养液中加入四氢大麻酚，配制一系列不同四氢大麻酚浓度的检测组标准液；检测组标准液中分别加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应后，进行检测胞内荧光蛋白的荧光值PF和荧光钙离子的荧光值Ca²⁺F，以测得的荧光值Ca²⁺F/荧光值PF比值作为纵坐标，以四氢大麻酚的浓度为横坐标绘制标准曲线，计算拟合回归方程；